对于刚入门的科研小白,免疫组化步骤较为繁琐,而且一步错,步步错,有时候明明觉得自己都按照老师们提供的条件做,可惜就是没有得到预期结果,现我将自己的些许体会分享如下。 关于免疫组化的定义,原理,分类,优势等不再一一介绍(丁香园等主流平台都有介绍),我只叙述我认为「比较小」的问题,但这些往往决定了成败,遗憾的是我检索了比较多的资料,都没有详细的提及这些问题。 取材与制片 ① 一定要按照标本的标本留取要求留取,譬如某组织要求固定前要求用湿润的生理盐水纱布,用干纱布则会大大影响实验效果,导致输在起跑线上。 ② 制片厚度与均一程度很重要,若每张片子的厚度不同,则实验时所需条件的就会有差异,然我们不可能随意调整实验的反应时间,一般我们读研读博的医院都是研究型大学的附属医院,建议交由大病理科完成制片,由于某些科室有亚专科,由于成立时间相对较短,制片水平不如大病理科。 反应温度 本人建议常规 4 ℃,背景浅,反应温和,但长须过夜。也有些试剂推荐 37 ℃,反应较快,最不提倡的是室温,因为波动较大,如果非得用室温,譬如 25 ℃,建议使用水浴恒温箱。 如何取抗体 以抗体 1:1 000 稀释为例,枪头吸取 0.5 ul,首先这个很难观察到底取了多少,误差太大,假设不小心枪头外周沾了一抗很难察觉,所以建议梯度稀释法较妥,建议在不影响实验可换别的试剂,譬如 1:50 稀释,在误差不可避免的情况下降低影响。 如何滴加相应试剂 最简单粗暴的方式是将所有玻片同时浸入泡缸内,但是由于试剂昂贵,此法基本不可行。 很多采用移液枪滴加(每次约 50~100 ul 就能解决问题),但这就带来了新的问题,假设有 10 张玻片,每滴加一张所需时间为 20~30 s,从第一张到最后一张相差将近 5 min,如果最后一张滴加完在开始计时,假设反应时间为 5 min,那么第一张片子实际反应时间为 10 min,而只有第 10 张玻片反应时间为 5 min。 此问题在单人操作中尤其明显,需要操作者把握时间。当然假设你的反应时间为 12 h,那么 5 min 我认为就可以忽略。 平整放置玻片 玻片反应是一定要平整放置,不然液体流动导致反应时部分组织干片,无法着色或染色时出现非特异性着色。 染色时间 建议镜控,一张成功的免疫组化片子一定是轻松染色的,不用通过增加染色的时间来「提高」成功率,相反,一味延长染色时间容易导致非特异性着色。 如何插拭玻片 在经过 PBS 浸泡后,不要企图将组织上的液体彻底插拭干净,因为这样更容易干片,尽量甩干,但组织周围的液体一定插拭干净,这样滴加上去的液体由于表面张力不易流动。 所有操作中均要遵循的原则:不能干片 (除非实验步骤中有要求干片) 所有试验步骤操作方法均不难,难的是出现了问题如何取解决,由于整个流程中关键的步骤就那么 3~4 步,但是一旦出现问题,由于排列组合的原因,会出现多种组合,变得异常繁琐。所以一定要多思考。 另附出上述常见小问题导致失败的图片,供大家参考 脱片(右上角),酶消化程度尚且不够 注:如何防止脱片,已经在另一篇文中详细说明 染色时间过长导致非特异性着色 干片导致非特异性着色 过度消化-可见管腔内「光秃秃」,可以被红色附着的寥寥无几 同样的片子,同样的方法,注意了这些「小问题」后,实验结果确实是另一番结果: 成功的-100X
来源: 生物学霸
我有话说......
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