免疫层析微球标记技术大揭秘

作者：Artemis Dx的联合创始人兼COO

侧向层析（LFA） 因其简单、快速和低成本而被广泛使用。它们是依赖于生物分子之间相互作用的免疫测定法，通常通过沿多孔膜或微流体途径的运动来显示结果。

现代 LFA 使用有色颗粒来生成结果，在非竞争性检测（例如 hCG 测试）中为彩色线，或者在竞争性检测（例如 THC 测试）中没有彩色线。因此，颗粒耦合技术是 LFA 成功的关键步骤。

显著影响 LFA 的灵敏度、特异性和整体性能的一个关键因素是选择有色颗粒（如金纳米颗粒、微球、纤维素纳米珠或其他类型的纳米颗粒）作为视觉指示剂以及用于制备这些颗粒的偶联方法。

似乎所有字段都有可能用词不当的术语。侧向层析诊断也不能幸免于这种做法。根据化学定义，“共轭物”“是由两种或多种化合物通过 Pi 键连接形成的”。因此，与颗粒非共价偶联的分子不是共轭物。然而，与其反对当前的术语，不如说 conjugation 和 coupling 在这篇综述中将具有等效的含义。

该领域的另一个用词不当是“乳胶颗粒”。微球颗粒不是乳胶，它们实际上是聚苯乙烯球。同样，在本次综述中，乳胶颗粒和微球将具有等效的含义，而不是反对当前的术语。

以下是对侧向层析分析中用于颗粒标记的一些常见偶联技术的粗略回顾：

共价偶联是粒子偶联中最可靠和应用最广泛的方法之一。在这种技术中，官能团（如胺、硫醇或羧基）被引入颗粒表面，这些基团与抗体、抗原或酶等生物分子形成强共价键。牢固的键确保生物分子在整个检测过程中保持附着在颗粒上。

• 优势

• 偶联物在具有挑战性的 pH 值、高表面活性剂浓度和缓冲盐摩尔浓度的各种溶液中具有很高的稳定性。

• 生物分子的强烈且不可逆的附着。

• 可与各种生物分子一起使用，例如蛋白质或核酸。

• 劣势

• 需要经过充分优化的反应，以避免过度偶联、偶联不足或与活性表位结合，这可能会改变颗粒功能。

• 可能交叉链接到意外网站。

• 需要特定的缓冲液和 pH 值才能以最佳方式形成共价键。

• 取决于技术。

• 常用技术

• 胺偶联（羧基颗粒与分子上的氨基结合）：这可能是最常用的共价偶联方法。仅一步碳二亚胺方法或两步碳二亚胺和 N-羟基琥珀酰亚胺方法将羧化颗粒共价偶联到目标分子上的氨基上。一步法有可能交联并形成大聚集体。必须避免在偶联溶液中使用不需要的氨基。必须避免使用 TRIS 缓冲液。

• 磺基偶联（磺基颗粒与分子上的磺基结合）：这种方法通常不常用，但如果靶分子上没有叔氨基或它们位于活性表位中，则可能有用。该技术激活颗粒和生物分子上的磺基，并迅速形成二硫键。

• 戊二醛交联（氨基颗粒与分子上的氨基结合）：戊二醛在分子的每一端都有活性羰基。因此，从理论上讲，gluteradehyde 的一端与颗粒上的氨基结合，另一端与蛋白质上的氨基结合。然而，交联的潜力很大，因为无法指定哪些氨基将被 gluteradehyde 结合。同样，必须排除在偶联溶液中使用不需要的氨基。必须避免使用 TRIS 缓冲液。

非共价偶联方法采用较弱的相互作用，如氢键、静电相互作用或疏水相互作用。这些方法通常比共价技术更简单、成本更低，但产生的偶联速率较低、生物分子未定向和偶联颗粒稳定性较差。

• 优势

• 比共价方法更容易制备，并且通常不需要试剂来传播偶联。

• 可用于共价偶联可能改变颗粒功能的情况

• 与共价偶联技术相比更便宜。

• pH 值和缓冲盐的选择不太重要。

• 劣势

• 颗粒稳定性降低，导致在某些测定条件下生物分子与颗粒发生潜在解离。

• 可能排除在测定缓冲液中使用表面活性剂的能力，因为表面活性剂可能导致生物分子与颗粒解离。

• 与共价偶联物相比，检测灵敏度（检测水平）较低。

• 一些分子可能不会非共价地连接到目标颗粒上。

• 常用技术

• 氢键： 这是分子之间的一种特殊类型的静电吸引。它不是与氢原子的共价键。它是由氢和非常负电的原子之间的吸引力产生的。

• 静电相互作用：颗粒通常带有一些正电荷或负电荷，特别是如果它们的表面有官能团，并且生物分子上的相反电荷导致生物分子吸附到颗粒表面。

• 疏水相互作用：这种方法利用某些生物分子的非极性性质，使它们不太“亲水”。这种疏水性促使它们附着在颗粒上。

当颗粒和生物分子之间需要高度特异性时，使用基于亲和力的技术，并且它们通常依赖于高度特异性的结合对。常见的系统包括物种特异性抗体-一抗相互作用、受体-配体相互作用或生物素-亲和素系统。

• 优势

• 高特异性，从而提高检测性能（最小的非特异性结合等）。

• 正确的生物分子方向，从而最大限度地提高特异性结合，同时最大限度地减少生物分子的使用。

• 颗粒上的生物分子覆盖率更高。

• 劣势

• 需要精确优化以确保所有结合位点都已淬灭。

• 由于需要高质量的抗体和另一种偶联生物分子，因此成本更高。

• 要求取向生物分子最初与颗粒结合。强烈建议将“取向”生物分子与颗粒共价键。

• 常用技术

• 生物素-链霉亲和素系统：该系统依赖于生物素和亲和素/链霉亲和素之间的强、高亲和力、非共价结合，将生物分子与颗粒连接起来。通常，链霉亲和素与颗粒共价结合，生物素与靶分子（例如抗体）共价偶联。生物素化的生物分子与链霉亲和素颗粒一起孵育，生物分子通过生物素-亲和素键与颗粒结合。

• 抗原-抗体结合：该系统采用“2nd”抗体，一种动物特异性抗 IgG，通常与颗粒共价结合。靶标特异性抗体与 2nd“ 抗体颗粒一起孵育，靶标特异性抗体通过抗体-抗体键与颗粒结合。

• 蛋白 A/G 抗体结合： 该系统还依赖于蛋白 A 或蛋白 G 或两者的混合物之间的强、高亲和力、非共价结合，将抗体与颗粒连接起来。蛋白 A 和蛋白 G 具有独特的结合靶标，因此了解您希望其结合的抗体的种类和亚类非常重要。通常，蛋白 A、G 或 A/G 与颗粒共价结合。靶标特异性抗体与该包被的颗粒一起孵育，抗体通过蛋白 A、G 或 A/G 键与颗粒结合。

表面改性涉及改变颗粒表面的物理或化学性质以促进耦合。这些修饰可以与共价或非共价方法结合使用。

• 优势

• 表面改性有助于提高颗粒分散性、稳定性和偶联效率。

• 允许控制颗粒大小和表面化学性质，以优化偶联过程。

• 劣势

• 表面改性会增加生产过程的复杂性。

• 需要高质量的控制以确保一致性。

• 常用技术

• 聚合物涂层：用聚乙二醇 （PEG） 等聚合物包覆颗粒可以减少聚集，增强稳定性，并为偶联提供反应基团。

• 二氧化硅涂层：二氧化硅颗粒通常涂有功能化硅烷，以促进生物分子偶联。

金纳米颗粒偶联

• 金纳米颗粒 （AuNP） 是侧向层析测试中使用最广泛的颗粒，因为它们具有独特的红色，即使在低浓度下也可见。这些纳米颗粒的表面通常没有功能化，因此与这些颗粒的结合是非共价的。通常，40 nm 颗粒用作最佳金纳米颗粒。

表面改性金纳米颗粒偶联

• 金纳米颗粒现在市售的表面是羧基改性的，因此允许通过共价键或使用如上所述的接头分子来连接生物分子。

聚苯乙烯微球（乳胶颗粒）偶联

• 聚苯乙烯微球，通常称为乳胶颗粒，用作金纳米颗粒的替代品。这些颗粒在市场上可以买到，微球表面用胺、磺基或羧基功能化，允许通过共价键或使用如上所述的接头分子连接生物分子。它们有多种颜色可供选择，可通过颜色区分生产线。它们具有共价偶联颗粒的优点：高稳定性、强且不可逆的附着以及结合各种生物分子的能力。大多数情况下，选择的粒径为 300 至 400 nm。

胶体银颗粒偶联器

• 与金纳米颗粒类似，胶体银纳米颗粒可用于 LFT 进行视觉检测。颗粒有羧基表面改性或非表面改性两种形式，因此允许共价或非共价偶联。尽管胶体银颗粒是金纳米颗粒的一种经济高效的替代品，但 LFA 中已很少使用胶体银颗粒。

陶瓷或二氧化硅颗粒耦合

• 硅基颗粒有时用于侧向层析测试，通常用于需要特定表面特性或稳定性的情况。这些颗粒可以使用硅烷化学（例如氨丙基硅烷）进行功能化，与抗体或酶等生物分子共价键合，从而提供与其他共价偶联颗粒相同的优势。

纤维素纳米珠 （CNB） 偶联

• 这些微珠通常未进行表面修饰，因此与这些微珠的结合是非共价的。最近，它们还可以购买羧基表面改性，从而允许共价键或静电相互作用。这些颗粒通常为 300-400 nm 大小，有多种颜色可供选择，颜色非常浓郁，使用的生物分子比金少 5-10 倍，并且更具成本效益，尤其是使用中等到昂贵的试剂。表面改性的 CNB 具有共价偶联颗粒的所有优点：高稳定性、强且不可逆的附着以及结合各种生物分子的能力。

颗粒和偶联技术的选择对于侧向层析分析的成功至关重要。因此，必须了解样品类型和靶向检测分子特性，以正确选择可提供最佳检测信号的颗粒和偶联技术。并非所有颗粒在所有样品类型中都表现良好。共价偶联提供强而稳定的偶联物，而非共价和基于亲和的偶联方法则易于使用且具有特异性。金纳米颗粒因其光学特性而是一种流行的选择，但其他类型的颗粒（如聚苯乙烯微球或纤维素纳米珠）也具有明显的优势，具体取决于检测的具体要求。优化侧向层析分析的关键在于为您的应用选择最佳颗粒以及正确的偶联策略，以确保与分析目标、成本限制和所需的测试性能保持一致。