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前言 感染性疾病仍是全球主要的公共卫生威胁之一，及时准确的病原学检测对于感染性疾病的诊治至关重要。传统的病原体检测方法，如涂片镜检法、培养法、免疫学方法和分子生物学技术等，在临床检测中发挥着各自优势，但也存在不同的局限性。随着测序技术和平台的不断进步，靶向高通量测序技术(targeted next generation sequencing,tNGS)在感染性疾病病原体检测中展现出显著的潜力和优势，其应用领域也将更加广泛。 为保证tNGS在临床应用更加规范，提高tNGS技术应用于感染性疾病病原体诊断的质量，明确tNGS应用场景，有效实施质量管理，由国家感染性疾病临床医学研究中心主任卢洪洲牵头，联合全国41家医院感染、检验、微生物、危重症方向近60名权威专家共同参与的《靶向高通量测序技术应用于感染性疾病中国专家共识》(以下简称《共识》)于2024年12月在《中华临床感染病杂志》出版。
《共识》于2024年年初启动，9月于国家感染性疾病临床医学研究中心2024年年会暨第十五届结核病东方论坛正式发布。《共识》汇集多方智慧，采用2011版牛津大学循证医学证据分级与推荐意见强度分级方法，对循证医学证据等级和推荐意见强度进行了评估，旨在为tNGS技术在临床抗感染诊治能力等方面提供专业的指导和建议，助推精准医疗和全球健康管理的进步。
从左至右依次为：中山大学附属第五医院感染科主任丁立、山东省公共卫生临床中心副院长汤伟、国家感染性疾病临床医学研究中心主任/深圳市第三人民医院院长卢洪洲、华大基因CEO赵立见、香港大学公共卫生病毒学系潘烈文、深圳市第三人民医院感染科主任袁静 tNGS临床送检指导建议 感染性疾病的病原体类型复杂，如病毒、细菌、真菌、其他非典型病原体或混合感染等。而感染传统培养阳性率较低，未及时治疗，可能会导致更为严重的并发症，特别是老年人、年幼儿童、肥胖者、孕产妇和有慢性基础疾病者等高危人群较易发展为重症病例，应当给予高度重视，尽早明确病因，给予对应的药物治疗，降低重症风险[1,2]。《共识》针对疑似呼吸道系统、血流系统、中枢系统、泌尿系统、脊柱关节等感染情况，给出了明确的tNGS送检指导意见。 建议1 对于以下疑似下呼吸道感染的非重症患者，建议进行tNGS检测： (1) 传统微生物检测尚未明确病原体； (2) 经验性抗感染治疗2~3 d效果不佳； (3) 高危人群包括儿童、老年人、孕妇、肥胖、存在基础疾病等(B2b)。 建议2 对于以下疑似中枢神经系统感染的非重症患者，建议进行tNGS检测： (1) 经验性抗感染治疗2~3 d效果不佳； (2) 传统微生物检测结果阴性的脑膜炎、脑脊髓膜炎、脑炎和疑似颅内感染占位性病变； (3) 新生儿(B2b）。 建议3 对于以下疑似血流感染(bloodstream infection,BSI) 的非重症患者，建议进行tNGS检测： (1) 传统微生物检测结果阴性； (2) 经验性抗感染治疗2~3 d效果不佳； (3) 儿童、孕妇、老年人、存在基础疾病的高危人群(B2c）。 建议4 对于以下疑似泌尿系统、脊柱关节感染的患者，建议进行tNGS检测： (1) 传统微生物检测结果阴性； (2) 经验型抗感染治疗2~3d效果不佳(B2b)。 区分tNGS及mNGS的 临床送检场景和优劣势 社区性感染暴发应采取准确、快速、全面的方法以尽快明确病原体，医院感染管理科、疾病预防控制中心等部门方可根据病原体采取有效的防控措施。tNGS针对的是已知的、临床常见的病原体，因此对于新发病原体，该方法很有可能会发生漏检，此时mNGS具有病原体覆盖更广的优势，共识明确区分了mNGS和tNGS的送检场景和优缺点[3,4]。 建议6 对于以下感染情况，优先考虑mNGS送检： (1) 传统方法检测病原体尚未明确且病因不明的危重症患者； (2) 病因不明的免疫功能缺陷或抑制患者； (3) 社区聚集疑似新发病原体暴发流行的病例(B2b）。
tNGS样本采集送检规范 《共识》指出样本采集环节建议在使用抗菌药物治疗之前，如果患者已经使用抗菌药物治疗，应在下一次用药之前进行采集。样本的选择须结合患者自身情况、流行病学、病原体特性、受累器官及感染部位等状况综合考虑，共识强调了样本采集保存和运输规范。怀疑上呼吸道感染时，可选择鼻咽拭子/口咽拭子；怀疑下呼吸道感染，尽可能采集BALF进行检测，提高检测结果的准确性。
tNGS检测及数据分析 基于不同技术的tNGS具有各自的独特优势，基于探针捕获技术的tNGS (hybrid capture-based tNGS,hc-tNGS) 通过设计特异性探针捕获目标病原体的核酸序列，可以显著提高对目标病原体检测的序列数和覆盖度，可检测几百到几千个靶标[5]；基于多重PCR技术的tNGS (multiplex PCR-based tNGS,mp-tNGS)通过设计多重PCR引物对目标病原体的核酸进行富集，实验步骤相对简单快捷，几个小时就能完成建库和测序流程，适用于检测几十到几百个靶标[6]。 建议10 对于基于探针捕获技术或者多重PCR技术的tNGS技术各有优缺点，实验室需要根据具体的临床需求、适用场景、样本类型、预期的病原体种类和数量、实验室的设备和技术水平等因素进行综合考虑选择(C4)。 测序数据量直接关系到tNGS应用于感染性疾病病原体诊断的灵敏度和特异度。较高的数据量可以提高低丰度病原体的检出率，并且有助于区分真正的病原体序列与背景噪音，减少假阳性和假阴性结果，从而提高诊断的准确性[7,8] 。 随着科技的进步和医学诊断需求的提升，医院内部检测能够显著缩短样本处理和结果报告的时间，有助于医疗团队更迅速地获取关键的诊断信息，从而及时调整治疗方案并提供紧急护理，也有助于更好地控制传染病的传播；在复杂病例中，更短的检测周期可为临床多学科诊疗模式(multi-disciplinary treatment,MDT) 探讨争取时间，有助于更有效地指导临床治疗。 建议14 建议下机数据中单样本平均数据量≥1 M，识别正确率超过99.9%的碱基占比(Q30) ≥ 85% (B3b）。 建议17 实现tNGS医疗机构本地化检测能够较好地进行实验室管理与人才培养，提高对抗传染病的应急响应能力(D5）。 tNGS长读长展望 随着测序技术水平的不断突破，其读长实现了从数千碱基到数百万碱基的飞跃，即靶向长读长测序。长读长有助于提高拼接的完整性和准确性，通过靶向特定基因区域，可以用于病原体的识别和追踪，帮助研究病原体的传播路径、基因型变异及地域性流行病的特征。靶向长读长测序可通过特定的捕获技术，对临床标本中微生物的核酸，耐药/毒力基因进行靶向富集，从而获得更多的检测数据信息[9]。靶向长读长测序以其便携高效、长读长等特性，能够在微生物的种类鉴定及发现新型(未知)耐药突变方面发挥关键作用[10]。尽管长读长测序在准确性和灵敏度上有优势，但目前其成本较高，尤其是在大规模流行病学调查和常规临床应用中，仍然需要突破。 总 结 tNGS在病原体诊断中的发展充满潜力，未来将在多个方面促进感染性疾病的诊断和治疗。《共识》将不仅促进tNGS技术在临床诊断中的标准化应用，还将有益于业界的良性互动，为提升临床抗感染诊治能力提供有力支持，助力临床医生为患者带来更高效、更便捷的诊疗服务，在提高诊断准确性、加速治疗决策、控制耐药性及应对全球健康挑战等方面发挥重要作用。 参考文献： 滑动查看 |
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