qPCR的实验流程！一看就会，一学就废！

一. 什么是qPCR(实时荧光定量PCR)

实时荧光定量PCR（qPCR），全称为Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，是一种先进的分子生物学技术，它结合了传统的聚合酶链式反应（PCR）与荧光检测系统，能够在PCR扩增的过程中实时监测目标DNA或RNA的数量变化。在qPCR中，荧光信号的积累与PCR产物的形成同步进行。当荧光信号达到预设阈值时，所经历的循环次数被称为Ct值（Cycle threshold）。这个Ct值与起始模板的数量呈负相关：即起始拷贝数越多，荧光信号越快达到阈值，Ct值也就越小。通过构建标准曲线，可以将未知样本的Ct值转换成具体的起始模板数量，从而实现对样品中目标核酸的绝对或相对定量。

二. qPCR的实验设计

1. 样本预处理

拭子样本：保存在病毒保存管中，灭活病毒-20℃可保存1月，-80℃保存1年。非灭活病毒4℃保存48h，若无法及时检测需保存在-80℃。

血液样本：应采用含有抗凝剂的真空采血管保存，4℃保存不超过7天，-80℃可长期保存。

血清血浆样本：采集全血后，静置1-2h，置于离心机内3000rpm离心15min，获得血清或血浆。在-20℃可保存15天。-80℃可长期保存。

组织样本：选择高丰富度的肝脏，脾脏，心脏等新鲜样本使用生理盐水清洗，然后研磨成浆，若不能立即进行核酸提取需要在液氮中进行冻存，-20℃下可短期保存，-80℃可长期保存。

粪便样本：将样本充分打散，使用裂解液充分裂解，4h内进行核酸提取或者-80℃保存。

2 .核酸提取

核酸提取方法详见往期文章《如何提取样本中的核酸？样本裂解的3种方法及核酸纯化的7种方式！》。以下列举两种方式：

2.1 吸附柱法

这种方式操作简单，更安全和快速，且产物纯度高。但存在堵柱的风险，样本的起始量有限。但可节约很多时间。

2.2 磁珠法

该方法通量高，可实现自动化操作，产物纯度高，但需要磁力架或者自动提取仪器，成本相对较高。适用于人员不足样本量多的情况。 

3. 实验前准备

3.1 样品准备

RNA提取

从待检测样本（如细胞、组织或体液等）中提取目标RNA。这一步骤对于确保后续实验的成功至关重要，因为高质量的RNA是获得可靠结果的基础。通常使用TRIZOL试剂或其他类似的裂解液来抽提总RNA，并通过离心分离出水相中的RNA

RNA质量检测

为了保证RNA的质量，需要对其进行纯度和浓度的评估。常用的方法包括紫外吸收法测定A260/A280比值以判断纯度，以及变性琼脂糖凝胶电泳检查完整性。理想的A260/A280比应在1.8到2.1之间；而在电泳图谱上应看到清晰的28S和18S rRNA条带，且前者密度约为后者的两倍

3.2 cDNA合成 (仅适用于RNA样本)

如果起始材料是RNA，则必须先将其反转录成互补DNA (cDNA)。此过程可以通过一步法或两步法完成。一步法简化了操作流程，适合高通量筛选；而两步法则提供了更高的灵活性，允许在不同时间点进行多个基因表达水平的比较

• 一步法：将RNA模板与逆转录缓冲液、引物、dNTPs及逆转录酶混合，在适当的温度条件下孵育，直接生成可用于qPCR扩增的cDNA。

• 两步法：首先单独进行逆转录反应制备cDNA池，之后再独立设置qPCR反应体系。这种方法可以更好地控制每个环节的质量，但增加了实验步骤。

需要将RNA反转录成cDNA，要确保得到的cDNA能够满足实验需要，包括预实验在内。通常使用的试剂为ATGScript RT mix for qPCR(+gDNA wiper)(ATG#R113)，这种试剂方案以Mix形式提供，便于用于qPCR中的cDNA合成。为尽可能的消除个体差异带来的影响，可在提取RNA时将多个组织样本混合后取一些提取RNA。

4. 两步法qPCR

两步法qPCR在第一步中，得到的cDNA是很多基因的cDNA总库，我们需要根据需要设计特异性引物，不同引物的话要分开跑q。

4.1 规划孔板，计算试剂用量

通常引物按行排列，样品按列分布，需要设置复孔，避免微小的差距带来的结果判断方面的影响。一般可设置2个复孔。1个内参。设计实验时，可设置3个生物学重复，如下图所示，6个样品中，3个实验组，3个对照组。

4.2 配Mix

根据所选用的化学方法（SYBR Green I染料或探针），按照制造商提供的指南配制反应混合物。典型的反应成分包括：

• SYBR Green I染料或荧光探针

• 特异性引物对

• dNTPs

• Taq DNA聚合酶

• MgCl₂

• 缓冲液和其他辅助因子

• 模板cDNA

引物处理：将订购的干粉引物，离心1min后再加入纯水复溶地道道100μmol/L的复溶液，另外取一个EP管按照以下比例配置工作液：

DEPC水：上游引物：下游引物=80：10：10，既可得到上下游引物均为10μmol/L，并做好标记。

cDNA处理：将获得的cDNA稀释，在逆转录体系上稀释2-5倍（可根据自己具体情况来），如果有4个引物，则需要4个EP管。6个样品需要6个EP管，按照2个复孔设置。考虑移液损耗，mix需要多配几个孔。

引物1中：引物+SYBR:（4+12）*1=16ul引物+（12+4）*5=80ul，SYBR

样品1：DEPC水+cDNA:（8+4）*3=36ul水+(8+4）*1=12ulcDNA

4.3 点样

先点完mix1，把孔板旋转90°，再点mix2，期间记得调枪。SYBR有些粘稠，注意先吹打几次润湿内壁，慢吸快打，SYBR+引物用用反向移液法先加，不换枪头；CDNA和水可用正向移液法。

mix1加完后侧壁可看到加和没加的区别，mix2可以用数枪头法。注意mix1到mix2要调枪就行。

4.4  封板，甩板，上机

在4℃，3500rpm，5min，离心机需要预冷，甩板能将各个组分混合，虽然温度条件不同，但可能会部分反应影响结果，一般甩板后立即上机，如果仪器限制，4h内跑也可以（网友说的）。封板后若当天没有预约到仪器，可以放到4℃过夜，上机前在甩板一次就行。

将配置好的反应体系装载到荧光定量PCR仪中，并设置好相应的热循环参数。一般而言，一个完整的PCR循环包含三个主要阶段——变性、退火和延伸。例如，95°C下变性10秒，60°C下退火30秒，72°C下延伸30秒，重复35至45个周期。某些仪器还允许用户自定义额外的预处理步骤，如初始高温激活聚合酶活性。

以上就是qPCR实验的基本流程概述。值得注意的是，在实际操作过程中，还需要遵循严格的实验室规范，比如防止交叉污染、优化反应条件等，这些都是保证实验成功不可或缺的部分。