如何选择正确的方法进行细胞的支原体检测?支原体的检测方法有哪些?目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光指示细胞法、PCR 法、扫描电子显微镜法,这些方法各有优缺点。各实验室可根据具体情况,选择不同的方法,或几种方法联合使用。一、培养法 2. 支原体琼脂培养基 按说明称量粉剂,蒸馏水配制,高压除菌(加20%胎牛血清)。 3. 其他 超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管/皿、37°C 培养箱。 2. 准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基(半流体)。 3. 将样品分别接种到10ml 精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中(已冷却至36℃) ,每支培养基接种样品0.5~ 1.0ml. 每种样品接种6 支精氨酸肉汤培养基,3 支半流体培养基。 4. 接种6d 后,取3 支精氨酸肉汤培养基中样品0.5 ~ 1.0ml. 复种于精氨酸肉汤培养基中。 5. 36 ℃ 培养29d, 每隔3d 观察一次。记录实验结果。 半流体培养基中如有支原体生长,则出现絮状沉淀 二、荧光指示细胞法 荧光指示细胞法较为快捷,方法简单,但其灵敏度有一定的欠缺, 易造成漏检。 常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱,其激发波长为350nm(紫外激发),发射波长为420nm。该染料会结合到DNA 中富含A-T 的区域,由于支原体的DNA中A-T 含量占多数(55%~80%),所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点,即为支原体DNA, 证明该细胞有支原体污染。 (一)材料与设备 1. 荧光显微镜。 (二)操作步骤 (三)结果判断 (四)小结 三、PCR 法 2. 模板的制作。在无菌的条件下, 取细胞培养上清1 00μl 于一无菌的0.5ml塑料离心管内,盖好盖子, 95 ℃ 水浴加热5min 。 3. 打开盖子,向管内加StrataClean Resin 10μl,盖好盖子,旋涡混悬器混合,离心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料离心管中,模板制作完毕, 4℃ 保存。 4. PCR 反应。反应体系的最适条件为10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2,200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶,总反应体系为50μl , 反应用去离子水均需用紫外灯照射。 (1)在0.5ml 塑料离心管中加入35.2μl 去离子水及5μl 10 xTaq 反应缓冲溶液。 (2)依次加入下列成分:0.4μl dNTP (25mmol/L)、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。 (3)加2μl 去离子水,总体积45μl 。 (4)加5μl 已制成的模板到反应体系中。 (5)阳性对照,内对照各5μl 加入到各自的反应体系中。 (6)取1支含有以上反应体系的离心管,加入5μl 去离子水作为阴性对照管。 (7)在反应体系中加入100μl 矿物油。 (8)PCR 程序见下表。 5. 琼脂糖凝胶电泳。PCR 反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶浓度为2%。电泳结束后,凝胶成像分析结果。6. 结果分析。该方法为检测支原体的定性方法,在电泳泳道上, Marker、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带, 当被检样品泳道出现明亮条带,且位置在阳性对照和内对照条带位置之间,即可认为该样品被支原体污染 。 (三)注意事项PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。注意假阳性、假阴性,有时需多次重复。 四、扫描电子显微镜法 2. 37°C , CO2 培养箱中培养24h , 取出盖玻片。 3. 以PBS 洗涤3 次。 4 . 以2 .5%戊二醛/PBS 固定15min , PBS 洗涤。 5 .以1%锇酸固定30min, PBS 洗涤。 6 . 乙酸异戊酯脱水。 7. CO2 冰点干燥。 8. 喷金。 9 . 扫描电镜观察,照相。 本文编辑:小珍 |