一文了解，结核病免疫学检测！

结核病一直是全球严重的公共卫生问题，也是我国重点防控的传染病之一。尽管“肺结核诊断标准(WS 288-2017)”中已将结核分枝杆菌核酸检测阳性纳入结核病确诊依据之一^[1]，但临床仍然存在大量病原学阴性的结核病患者，需要依靠免疫学检测技术进行辅助诊断。

MTB侵入人体后，被免疫系统识别，诱发固有免疫和适应性免疫应答。固有免疫应答是机体抵御病原体的第一道防线，单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等固有免疫细胞发挥吞噬作用，针对MTB入侵迅速应答，产生效应分子，抵抗MTB侵袭，清除巨噬细胞内的MTB，发挥非特异性抗结核免疫防御作用。

在适应性免疫应答中，抗结核免疫主要由T细胞（包括CD4⁺和 CD8⁺Ｔ细胞等）介导。CD4⁺T细胞分化发育为Th1辅助细胞，Th1细胞产生γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素２（IL-２）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）等Th1型细胞因子，激活巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。活化的巨噬细胞吞噬和杀伤MTB能力明显增强。活化的CTL通过自噬、凋亡和杀伤机制使被MTB感染的巨噬细胞凋亡，或通过颗粒酶介导溶解被感染的巨噬细胞，使藏匿于细胞内的 MTB重新释放并最终被杀灭。Ｂ淋巴细胞和抗体介导的体液免疫应答发挥辅助的抗结核作用^[2]。

结核分枝杆菌（MTB）侵入宿主后引发的免疫病理反应及抗结核免疫应答反应是开发免疫学检测技术的基础。参与免疫应答不同阶段的各类细胞、细胞因子、趋化因子、抗体等都是潜在的免疫学诊断靶标。应用于临床的MTB感染检测技术包括血清学诊断、结核菌素皮肤试验（TST）和γ-干扰素释放试验（IGRA）等^[3]。

血清学诊断是以MTB感染后引发的体液免疫为基础，检测MTB抗原或抗体，主要基于酶联免疫吸附试验（ELISA）、酶联免疫胶体金渗滤法、胶体金免疫层析法、蛋白芯片技术等。由于具有操作简单快速、实验技术要求低、价格低廉等优点，曾经是我国结核病诊断的重要辅助手段。但是，2011年WHO对94项商业化结核病血清学检测试剂盒进行了系统评估，认为血清学检测试剂的敏感度（０％～100％）和特异度（31％～100％）变化巨大，存在大量假阳性或假阴性结果，故不推荐使用。

结核菌素是一种蛋白质，这种蛋白质来源于已高热灭活的结核杆菌。在大多数受感染者中，免疫系统将识别结核菌素，引起对结核菌素的反应。TST基于IV型超敏反应（即迟发性超敏反应）。通过皮内注射结核菌素，一段时间后观察硬结大小，判断机体是否存在结核分枝杆菌感染。

在未出现更先进的免疫学诊断技术前，TST检测是检测MTB感染的重要工具，也是结核病的重要辅助诊断工具，已沿用上百年。但是，由于传统的结核菌素使用结核菌素纯蛋白衍生物，因此容易与卡介苗或非结核分枝杆菌产生交叉反应，导致特异度低。结核菌素试验阳性有以下几种可能：

（1）正在感染结核；

（2）有结核感染史；

（3）有疫苗接种史。

所以结核菌素试验阳性不代表一定有细菌在活跃复制，无法区分活动性结核病和LTBI。

目前，国内外都在研发新型皮肤变态反应原。主要是将ESAT-6和 CFP-10融合蛋白作为变态反应原，替代原来使用的结核菌素纯蛋白衍生物，能够提高诊断的敏感度和特异度，并且能够排除卡介苗的干扰。

IGRA是以宿主感染MTB后的细胞免疫应答为基础，通过检测MTB特异抗原刺激后释放γ－干扰素（IFN-γ）的特异性淋巴细胞数量（酶联免疫斑点法，ELISPOT）或直接检测IFN-γ水平（酶联免疫吸附法，ELISA）来判断机体是否感染MTB，是目前诊断MTB感染的有效工具，也是诊断结核病的重要辅助工具。

由于受排菌、感染状态、感染部位、取材部位等多方面的影响，我国菌阴结核病的诊断给临床带来了很大的困难。对于缺少细菌学诊断依据的活动性结核病(如菌阴肺结核等)，IGRAs可在常规诊断依据的基础上，起到补充或辅助诊断的作用。并且，ESAT－6和CFP－10主要存在于MTB复合群，而在卡介苗和大多数NTM中缺失，因此IGRAs的特异度较好。但IGRAs检查不能区分潜伏感染、活动性结核、陈旧结核。IGRAs阳性结果临床价值有限，其阴性结果对排除MTB感染有一定帮助^[4][5]。

IFN-γ诱导蛋白10（IP-10）属于CXC类的趋化因子，主要由IFN-γ诱导产生。IP-10主要由单核细胞、树突状细胞、NK细胞、成纤维细胞和内皮细胞分泌产生，对淋巴细胞、单核巨噬细胞和树突状细胞等有较强的趋化和功能活化作用。IP-10可通过CXCR3介导，引起粒细胞、单核、巨噬细胞及淋巴细胞的趋化活性和迁移，在Th1型炎症反应为主的疾病中CXCR3表达升高，与IP-10结合产生相应的免疫应答反应。活化的Th1细胞受IP-10的趋化到达病变组织，分泌IFN-γ，极化Th1细胞，参与抗结核免疫应答^[6]。

目前，国内外关于IP－１０ mRNA检测用于MTB感染诊断或结核病辅助诊断的研究有限。有研究表明，在结核特异抗原刺激后2.5～８ｈ内，IP-10 mRNA的表达量显著上调，而且能在较长时间内保持稳定的高表达。因此，IP-10 mRNA可能更适合作为MTB特异性细胞免疫反应检测的靶标。但国外一项研究发现结核特异抗原刺激后的IP-10 mRNA检测的诊断特异度与IGRA检测和IP-10蛋白检测基本一致，但是敏感度略低于其他两个靶标，这可能与结核抗原刺激时间的选择以及RNA提取方案有关。通常情况下，mRNA转录窗口期较短，较长时间的抗原刺激后可能已进入IP-10蛋白累积阶段，mRNA含量下降。因此，锁定恰当的结核抗原刺激时间，捕获处于高表达状态的mRNA对于提高检测性能至关重要。

IL-２是重要的Th1类细胞因子之一，既往研究发现，结核抗原刺激外周血淋巴细胞后，MTB感染者中IL-２表达量较未感染者明显升高。在抗结核免疫应答，IL-2能够促进中央记忆细胞向效应记忆细胞的分化^[7]。荟萃分析提示，在IFN-γ基础上增加IL-2检测可以提高MTB感染的特异性^[8]和检出率^[9]。Teyfik Turgut等^[10]发现IL-2表达水平高于非活动性结核和健康人，并且发现在治疗2个月后活动性肺结核患者IL-2初步下降，治疗4 ~ 6个月后降至健康人水平。表明IL-2可以作为鉴别活动性结核与潜伏感染的潜在标志物。

上述免疫学检测技术为结核分枝杆菌感染和结核病的诊断带来了新的希望。此外，尚有一些处在研发过程的新型蛋白标识物、多功能淋巴细胞等也表现出较好的潜在诊断价值。

新的诊断技术需要新的靶标，国内外研究者一直致力于探寻除IFN-γ之外的其他因子，希望通过单独或综合检测的方式来提高结核病或MTB感染的诊断能力。到目前为止，纳入评估的细胞因子超过100种，包括白细胞介素类 （IL-1α/β、IL-２、IL-４、IL-５、IL-６、IL-８、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27等）、趋化因子类（CXCL家族、CXCR家族、MIP-1α／β、MCP、RNATES、I-309等），以及其他细胞因子（TNF-α、VEGF、GM-CSF、CSF、MMP-9、TGF-β等）。

一项荟萃分析对56项研究进行了综合分析，其中研究最多的是IFN-γ、IL-２、TNF-α、IP-10、IL-10和IL-13。尽管多数研究认为各类细胞因子具有鉴别诊断结核病和LTBI的潜质，但各研究之间的异质性很高，并没有得到非常统一的结果。

结核抗原刺激后的Ｔ淋巴细胞，因分泌多种细胞因子而被认为是多功能细胞，表现为不同的细胞亚型和功能。在结核病研究中发现，分泌不同细胞因子的多功能Ｔ细胞亚型的数目和比例可能与不同的MTB感染状态相关。有研究表明，通过检测分泌TNF-α的CD4⁺Ｔ细胞数目、检测单分泌TNF-α的CD4⁺Ｔ细胞比例和结核抗原特异的CD8⁺Ｔ细胞数目、或者检测释放IFN-γ 并表达CD38、HLA-DR、Ki-67蛋白的CD4⁺Ｔ细胞数目，能够鉴别诊断活动性结核病和LTBI，而且可能作为监测治疗效果的标识物。

应用流式细胞仪或者多色免疫荧光技术检测特异性抗原刺激后释放多种细胞因子的淋巴细胞亚型，对于实现MTB感染的诊断，甚至是活动性结核病和LTBI的鉴别诊断可能具有较好的意义，但至今尚无相关的诊断试剂用于临床实践。

近年来，结核病免疫诊断技术的研发取得了巨大进展，特别是在IGRA技术之后，相继出现了基于IP-10检测和IL-2检测的MTB感染诊断新技术，一方面提高了MTB感染的检出率，另一方面在免疫低下等特殊人群中表现出较好的诊断价值。随着对MTB感染后宿主免疫应答机制的深入探讨，相信未来必然能够找到更理想的生物标识物，使得MTB感染和结核病免疫学诊断的敏感度和特异度进一步提高。