直接法ELISA & 间接法ELISA

酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked immunosorbentassay，简称ELISA），是一种利用抗原抗体特异性结合的特性，通过酶高效催化其底物显色来检测生物体液中一些分子的有无或浓度的分析方法。从方法学角度可以分为四种类型，分别是直接法、间接法、双抗夹心法、阻断法，今天小编想跟大家聊一聊直接法ELISA和间接法ELISA。

首先我们简单了解下ELISA技术发展史。

直接法ELISA是最早建立的一种ELISA类型，适用于分子量较大的抗体或抗原。以抗体检测为例：将抗原包被在反应板中，加入酶连接的特异性抗体，与固定化的抗原反应，加入合适的底物量，酶催化显色，通过检测光信号大小来进行测定。该方法灵敏度低，背景干扰大，目前很少使用。

间接法ELISA用于测定未知抗体或抗体效价，科学家在1978年第一次发表了间接ELISA检测IgG的方法^[6]，与直接法不同的是，间接法形成的是三级复合结构，将抗原包被于固相载体中并封闭残存孔隙，加入待检血清，作用一段时间后，再加入酶标抗抗体即酶标二抗，最后加入底物催化酶显色来判定。样品中的抗体被包被板上的抗原和酶标抗体夹在中间，显色深浅跟结合的抗体数量成正比。

直接ELISA和间接ELISA有一些共同点，比如固相载体相同，用于标记的酶、相应的显色液、终止液一般也是相同的。

I.固相载体

ELISA实验一般在孔板中进行，也有用膜材料和珠子作为载体的，使用最多的材料是改良后的聚苯乙烯。蛋白既可以在聚苯乙烯板表面被动吸收，也可以通过修饰进行共价偶联。将ELISA的反应物固定在微孔板表面，使其易于与未结合的材料分离^[7]。

表1. 固相载体材料及其特点

II.标记酶

用于标记的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、ß-半乳糖苷酶（BG）、脲酶（Urease），其中HRP分子量小，稳定，比活性高，纯酶容易制备且成本低，是最常用的标记酶。

III.显色液

显色液是能与酶标物中的酶反应发生颜色反应的物质，在以HRP作为标记酶的试剂盒中，主要采用TMB和OPD两种底物，OPD由于其具有致癌性已很少使用，目前常用的底物为TMB底物。

表2. 与HRP酶发生颜色反应的常见底物溶液

IV.终止液

终止液是用来终止酶与底物反应的液体，TMB的终止液有多种，常用强酸强碱溶液，可将蓝色转变成黄色或加深，叠氮化钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂也可使反应终止。

直接ELISA和间接ELISA最主要的区别在于所使用的标记抗体。一般来说，二抗是多克隆抗体，具有多个表位，多个二抗可以与单个一抗（待测抗体）结合，从而放大了检测信号，提高了灵敏度，但也因此具有更高的交叉反应风险。单克隆抗体只识别一个单一的表位，通常选择单抗作为一抗，以得到最高水平的特异性。对以上两种方法学的主要区别做一个对比，总结如下^[8]：

表3. 直接ELISA和间接ELISA的区别