诺如病毒的实验室检查

诺如病毒，是人类杯状病毒科（Human Calicivirus, HuCV）中诺如病毒（Norovirus, NV）属的一种病毒。是一种能够在全球范围内引起人和多种动物发生急性肠胃炎，导致严重腹泻的人畜共患病病原，也是一种重要的食源性疾病病原。诺如病毒的流行不仅对人群健康造成严重威胁，也产生巨大的社会经济损失。

诺如病毒传播途径多种多样、感染剂量低、排毒时间长、环境抵抗力强、病毒变异快、免疫保护时间短，具有高度传染性和快速传播能力。

诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻爆发中，60%-90%是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15%左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。

“诺如病毒”感染性腹泻属于自限性疾病，没有疫苗和特效药物，公众搞好个人卫生、食品卫生和饮水卫生是预防本病的关键，要养成勤洗手、不喝生水、生熟食物分开，避免交叉污染等健康生活习惯。

实验室检测

标本采集

多种病原体可引起急性胃肠炎聚集性或爆发疫情，应充分考虑不同病原体检测对标本采集和保存的特殊要求。因此对同一采集对象，应按照细菌、病毒、寄生虫等不同要求，采集、分装和保存多份标本，以备必要时做其他病原体检测、复核实验结果或进一步鉴定。采样时需填写标本信息登记表。

1.标本类型

⑴粪便

诺如病毒检测首选粪便标本。每份标本5g或5ml以上，直接放置于清洁、无菌、干燥的密闭容器内。容器内不可加入任何保护剂、培养基、去污剂或金属离子，不可稀释。

⑵肛拭子

肛拭子标本不能长期保存，且检出率低于粪便标本。肛拭子含粪便量很低时，如检测结果呈弱阳性，结果容易被误判，导致假阴性。采集时需注意肛拭子上应有可见的粪便，放入无菌带盖密闭采样管。采样管中应有2ml无菌PBS缓冲液或Hank’s液，液体需没过肛拭子棉签部分，并尽快检验。

⑶呕吐物

呕吐物每份标本采集5g或5ml以上，直接放置于清洁、无菌、干燥的密闭容器内。容器内不可加入任何保护剂、培养基、去污剂或金属离子，不可稀释。

⑷水

目前没有水样品采集量的权威规定。怀疑水源性爆发时，建议尽量采集1升以上的水样品。桶装水、瓶装水等直接采集原包装，自来水需要以无菌容器采集。采用膜过滤法浓缩后检验，有助于提高检出率。

⑸食品

由于食品成分复杂、病毒含量不高，从食品样品中提取诺如病毒RNA的回收率受限。本指南仅提供海产品、草莓、蓝莓和部分蔬菜的参考方法。推荐采集牡蛎、海虹至少10个，三文鱼200克，扇贝、毛蚶、文蛤等250克，草莓、蓝莓250克，生菜和芽苗菜等500克。食品样品应置于无菌容器中，立即4℃冷藏，当天运至实验室进行检验。

⑹环境涂抹样

根据疫情调查需要采集疫情发生机构相关场所如厨房、厕所、门把手、玩具等环境涂抹样品。可用无菌拭子在无菌PBS里蘸湿，用力涂抹待采表面（最大面积100cm）后，立即浸入核酸提取试剂盒裂解缓冲液中（QIAamp试剂盒560ul，Genaid试剂盒400ul） 。

2.标本采集对象

⑴病例

采集病例发病2-5天内的粪便、带便肛拭子或呕吐物标本。若病例在10例以下，全部采集；病例在10例以上，至少采集10例病例的标本。根据初步流行病学调查结果，尽量采集重点病例（如首发病例、指示病例、住院病例、发病的食品从业人员、重点岗位的病例等）的标本。

⑵重点人群

根据疫情调查需要，可采集食品从业人员、护理员等工作人员的粪便、带便肛拭子标本。重点采集近期出现过胃肠不适症状、直接接触食品的食品从业人员、直接接触早期病例的护理人员等。

3.标本保存和运输

标本在4℃冰箱可暂存12小时，之后标本应放置-20℃以下冷冻保存，需长期保存的标本应储存在-70℃冰箱，避免反复冻融。依据《人间传染的病原微生物名录》，含诺如病毒的标本属于B类包装分类，需按照UN3373规定进行包装和手续申报，并在冷藏或冷冻条件下运送。通常对于短途运输（1天以内），包装盒内放冰袋或冰排，长途运输（1-2天）需用干冰。但无论短途或长途运输，均需保证冻存标本在运输过程没有出现融化。标本送达实验室时应包装完整，包装盒内应有未融化的冰。在运输中应避免强烈震动、重力挤压等现象。标本保存和运送的条件应有详细记录。

标本检测

为避免实验室污染，食品、水、环境样品与病人标本不能在同一实验室检测，必须分别在独立的空间进行样品处理和检验。

1. 核酸检测和基因型鉴定

⑴Real-time RT-PCR

ORF1/ORF2区是诺如病毒基因组中最保守的区域，在同一基因型不同毒株间有相同的保守序列，根据这段保守区域可用于设计TaqMan为基础的Real-time RT-PCR的引物和探针。除可检测病例临床标本中的诺如病毒RNA外，引物和探针经优化提高灵敏度后，还可用于环境样本（如食物和水）的检测。Real-time RT-PCR的敏感性高于传统RT-PCR，可检测诺如病毒GI群和GII群。

⑵传统RT-PCR

采用传统RT-PCR对Real-time RT-PCR阳性标本的PCR产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因型。测定ORF2完整衣壳蛋白基因序列，是诺如病毒基因分型的金标准。基因组中四种不同的区域（Region A-D）均可用于诺如病毒基因分型，基于衣壳蛋白区Region C和D两区域分型效果更好。但对于GII.4变异株的进一步分型，仅根据Region C序列不足以区别，需进一步扩增Region D。

此外，还有近几年刚刚发展起来的LAMP、RPA、RAA等新型核酸快速检测技术 。

2.抗原检测

由于诺如病毒抗原高度变异（基因型超过29个）且某些基因型存在抗原漂移（如GII.4型），开发广泛反应的ELISA方法存在较大挑战。虽然目前已有商品化的试剂盒如IDEIA（Oxiod，英国）、SRSV(Ⅱ)-AD（Denka Seiken，日本）以及RIDASCREEN（r-Biopharm AG，德国），但其敏感性（36%-80%）和特异性（47%-100%）均不太理想。即使已通过美国FDA认证的RIDASCREEN诺如病毒第三代ELISA试剂盒，也没有在美国广泛应用。ELISA可适用于爆发疫情中大量样本的筛查，但不适合散发病例的检测。ELISA检测结果阴性的样本还需要通过Real-time RT-PCR进行第二次检验确认。鉴于ELISA试剂盒成本高、敏感性低，ELISA方法仅可作为辅助检测手段。