WB实验中常用的抑制剂及作用原理介绍

蛋白质纯化、提取过程中常受到其本身存在的水解酶的影响。在提取蛋白质的过程中细胞破碎释放出蛋白酶，这些酶在与欲提取的蛋白质接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质分解。因此，在蛋白质提取过程中，需要加人蛋白酶抑制剂以防止蛋白质水解以保持蛋白质的完整性。

1. 因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。

2. 由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，应注意在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂时应充分混匀，以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。

1.苯甲基磺酰氟化物( PMSF)

①抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶)，不抑制金属蛋白酶及大部分半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶;

②溶于异丙醇、乙醇、甲醇、1, 2-丙二醇。在水溶液中不稳定，在100%异丙醇内，259℃稳定;

③在室温下可保存一年;

④工作浓度: 0. 1 ~ 1. 0mmol/L;

⑤在水溶液中不稳定，必须在每一次分离和纯化步骤中加人新鲜的PMSF。

2.乙二胺四乙酸钠( EDTA-Na2 )

①抑制金属蛋白水解酶;

②溶于pH 8 ~9的水中，溶液浓度约0.5mol/L; .

③溶液在4℃下可稳定6个月以上;

④工作浓度: 0.2 ~ 1.5mmol/L;

⑤需加入NaOH调节溶液的pH，否则EDTA不溶解。

3.胃蛋白酶抑制剂

①抑制酸性蛋白酶(如胃蛋白酶)、血管紧张肽原酶、组织蛋白酶L和凝乳酶;

②1mg/mL溶于甲醇中，不溶解于水;

③储存液在4℃下一周内稳定，-209℃下可稳定6个月;

④工作浓度：0. 7 ~ 1 μmol/L。

4.亮抑蛋白酶肽

①抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶、血浆酶和组织蛋白酶B;

②10mg/mL溶于水;

③储存液4C下稳定一周，- 20°C下可稳定6个月;

④工作浓度：0. 5mg/mL。

5.胰蛋白酶抑制剂

①抑制丝氨酸蛋白酶( 如血浆酶)、血管舒缓素、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;

②10mg/mL溶于水，pH 7~8，在pH>12.8时失活;

③储存液4°C下稳定一周，-209°C下可稳定6个月，避免反复冻融;

④工作浓度：0. 01 ~ 0.3μmol/L。.

6.抑胃肽

①抑制天冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶)、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶和很多微生物的酸性蛋白酶;

②溶于甲醇，约1mg/mL,也可溶于乙醇或6mol/L乙酸(约300ug/mL)，不溶于水，4°C下至少一周内稳定;

③工作浓度: 0. 7μg/mL。

7.胱蛋白酶抑制剂

①抑制半胱氨酸蛋白酶，如木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、组织蛋白酶B和二肽酰肽酶;

②将500μg胱蛋白酶抑制剂溶解于含20%甘油的重蒸水中，-20°C冷冻，两个月内稳定;

③工作浓度: 250μg/ mL。

常见的磷酸酶有蛋白酪氨酸磷酸酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶，常用的磷酸酶抑制剂如下：

1. 氟化钠（sodiμm fluoride）：酸性磷酸酶可逆抑制剂；

2.焦磷酸钠（sodiμm pyrophosphate）：丝氨酸/苏氨酸磷酸酶不可逆抑制剂；

3.β-甘油磷酸（β-glycerophosphate）：丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可逆抑制剂；

4.正钒酸钠（sodiμm orthovanadate）：碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶可逆抑制剂：

5.钼酸钠（sodiμm molybdate）：酸性磷酸酶不可逆抑制剂；

6.二水酒石酸钠（sodiμm tartrate dihydrate）：酸性磷酸酶可逆抑制剂；

7. 咪唑（imidazole）：碱性磷酸酶可逆抑制剂。