抗酸染色（冷染法）标准操作规程

本试剂盒采用WHO推荐的Ziehl-Neelsen法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。

石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液

1.涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰

2 .固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色

3. 染色

3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色10分钟或更久，无需加温

3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水

3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止

3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水

3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色30秒钟

3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检

3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块

1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色

2. 报告方式

2.1 未找到抗酸杆菌

2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野

2.3 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野

2.4 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野

2.5 找到抗酸杆菌3+:发现抗酸杆菌1-9条/1视野

2.6 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野

每次用卡介苗做阳性对照

大肠埃希菌ATCC25922做阴性对照

1.每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆

2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止

3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长

4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意

5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射

6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热

7. 染色时勿使玻片上的染液干燥

分支杆菌属（结核分支杆菌、麻风分枝杆菌、非典型分支杆菌）、放线菌抗酸染色阳性，可初步鉴定细菌。