最近大家都想了解多重PCR检测病原体的体系设计方法，剽了赵博的经验，整理出了一份基于多重PCR技术的病原体体系设计指导原则，文档比较长，干货比较多，适合专业人士学习，小白看看就行了！！！ 目录如下，嫌弃长的赶紧绕道，别怪没提醒！！！

目录：

1     体系设计流程... 2

2     病原体信息获取... 2

3     序列信息获取... 2

4     序列处理筛选... 3

5     序列比对... 3

5.1      MEGA11使用方式... 3

5.2      MAFFT安装及使用说明... 4

6     保守性分析... 5

6.1     保守性分析... 5

6.2     寻找保守序列... 6

7     体系设计... 7

7.1      Primer Blast引物设计方法... 8

7.2      根据保守性手动设计引物探针... 8

8     体系特异性分析... 9

1   体系设计流程

2     病原体信息获取

信息来源文献报道、专利等公开资料。需要获取的信息如下：

• 病原体中英文名称、别名等，及现有检测的常用靶点名称等信息；

• 基因组核酸种类（长度、结构、DNA/RNA、单链/双链、正链/负链等信息）；

• 确认是否存在分型，及具体分型名称及分型原则（例如流感病毒分为甲流、乙流、丙流等；甲流根据H基因和N基因分为H1N1/H7N9；

• 确认是否存在近源物种，并确认近源物种的相关信息及交叉反应的风险（如甲流通常感染禽类，但有一部分能感染人；冠状病毒来源于牛、蝙蝠等动物，少部分能感染人）；

3     序列信息获取

从NCBI基因组数据库或其它公开数据库获取序列信息，常用数据库：

• NCBI基因组数据库，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/

• NCBI核酸数据库，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/

• NCBI病毒数据库，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/#/

  
  

序列下载原则：

• 尽可能多的获取基因序列；

• 优先获取完整基因组序列；

• 优先下载宿主为人的基因序列；

  
  

4     序列处理筛选

如序列信息较多，则需要进行筛选，常用筛选流程有：

• 剔除不完整序列，优先保留完整序列；

• 剔除杂质序列，数据库中常有非目标序列，需要人工剔除；

•             序列聚类分析，常用于判断多种基因分型；

5     序列比对

使用Mega、Mafft等软件进行分析，序列比对的目的是为后续保守性分析做准备。

• 序列较少时使用Mega进行分析（500条以内），

• 序列较多时需要使用Mafft进行分析；

  
  

    5.1     MEGA11使用方式

1. 所用序列需要为FASTA格式，使用MEGA11打开处理后的病原体核酸序列；
2. 选择全部序列，并使用MUSCLE算法进行序列比对，参数为默认即可；

   

3. 保存MEGA比对文件，并将比对后的序列保存为FASTA格式用于后续分析，文件名称为“病原体代号_Align.fa”；

   

5.2     MAFFT安装及使用说明

安装及使用方式可参考以下链接：https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/windows_without_cygwin.html，具体如下：

1. 下载MAFFT-Windows版本安装包，并解压；

2. 将待比对文件复制到解压后的文件夹中；

3. 单击MAFFT.bat，输入待比对文件名称（文件名包括文件后缀，如test.fa）;

4. 确认输出的文件名称、输出顺序（建议为4）、其它参数（为空即可），并输入“Y”确认开始比对；

   
   

   

   
   

5. 对完成后的序列文件可直接用于后续分析或处理。

   
   

6     保守性分析

    6.1     保守性分析

1. 该网站输入序列为比对后的FASTA文件，所有文件需要有相同的长度（空碱基用“-”表示）；

2. 根据以上链接打开genefisher2网站，选择Submission开始上传序列文件，模式选择第三项“c）DNA”，并单击next进入文件上传页面；

   

3. 选择需要上传的序列文件，并单击next进行阈值线设置页面。再次提醒，上传文件需要为比对后的FASTA格式文件，如存在序列长度不一致的文件会导致分析失败；

4. 需要尝试多种阈值线进行保守型分析，以确认最佳的保守区域，建议先选择99/98/95三个阈值进行分析；

   

5. 确认阈值线后开始进行保守性计算，并保留所有阈值线下的分析结果，并根据阈值线进行标记。分析结果可直接下载或以文本方式显示；

   

    6.2     寻找保守序列

使用MEGA打开比对后的序列文件，并将分析得到的保守序列复制到其中；下图方框内即为分析得到的保守序列，并根据阈值线进行命名；需要综合考虑不同阈值线下的保守序列，并优先选择最为保守的区域，确保把最保守的区域留给探针。

然后，剩下的交给运气了！！GOOD LUCK！！

7   体系设计

使用SnapGene保存引物探针序列，引物探针设计原则如下：

1. 如序列保守性较高，则可考虑使用NCBI Primer Blast设计引物；
2. 如保守性较差，则优先选择保守区域设计；
3. 扩增片段长度不超过150bp，通常在100bp左右；
4. 引物Tm值在60℃左右（使用IDT分析，在3mM镁离子、50mM钠离子、0.8mM dNTP和0.2μM Oligo的条件下计算Tm值），https://sg.idtdna.com/calc/analyzer
5. 探针Tm至高于引物Tm值3℃以上；
6. 对于RNA病毒，探针应设计在非反转录方向上（不干扰逆转录过程）
7. 根据序列特意引物Tm值可适当提高，通常不超过65℃都可以接受；

1. 对于保守性极高的序列（突变概率低于0.1%，拥有连续200bp以上的完全保守序列），使用Primer Blast根据特异性设计引物组合；在线工具地址链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome。
2. 打开以上地址，输入序列信息（不超过50000bp）。
3. 引物设计参数：扩增片段长度70-150bp，Tm值55-60℃，最适Tm值为57℃；
4. 特异性参比数据库选择人基因组、全部细菌基因组和全部病毒基因组；

7.2  根据保守性手动设计引物探针

1. 如果序列保守性较高或序列较长，则优先根据文献或专利等信息确认常用检测基因或片段范围；
2. 如保守性较差（保守序列较少）或基因序列较短，则在全基因组范围内寻找合适的检测片段；目前尝试过10Kb基因组范围内寻找保守片段（HIV）；
3. 从NCBI GenBank上下载一条完整的病原体基因组序列（参考序列），建议序列格式为.gb文件，并用Snapgene打开；
4. 将长度超过18bp且至多只有一个简并碱基的99%保守度的序列全部以引物的形式添加至此序列中；（可接受简并碱基数量可根据序列保守程度调整）；
5. 将最为保守的区域作为探针序列，并寻找扩增长度可以在70-100bp左右（150bp以内）的引物探针组合；
6. 上下游引物若没有合适的99%保守度的序列则可以选择95%或98%保守度序列。

8   体系特异性分析