《纳米孔测序在病原微生物检测中的应用专家共识》分析

本文是对专家共识的总结及分析，旨在回馈公众号粉丝及读者。

为保证专家共识传播的准确性，建议读者自行查阅原文件。（文末有全文）

专家共识的下载链接：

https://journal.china-pharmacy.com/thesisDetails?columnId=63979382&Fpath=home&index=0&lang=zh

一、引言

感染性疾病仍是全球公共卫生重大威胁，实现病原微生物快速精准检测对诊治具有重要临床价值。

临床实验室针对病原微生物的检测方法包括基于病原分离培养、免疫学检测和分子生物学检测，但各有局限性。

高通量测序技术为病原微生物鉴定提供新手段，其中第三代测序技术（TGS）因超长测序读长弥补了第二代测序技术（NGS）的不足，逐渐应用于临床。

纳米孔测序作为TGS的一种，具有设备小型化、便携等特点，在病原微生物检测等领域发挥重要作用，但其独有的特点导致现有高通量测序规范共识不适用于它，临床急需相关技术规范。

二、共识制定方法

由中国药理学会治疗药物监测研究专业基层委员会和广东省药学会临床治疗精准用药专家委员会联合发起，多学科专家编写和审定。

采用名义群体法确定编写大纲，编写组系统检索、分析、归纳相关内容并形成共识初稿。

采用德尔菲法邀请专家咨询，修订后确立本共识。

三、纳米孔测序

原理：将单分子检测和电流信号传导相结合，摆脱NGS的洗脱和PCR扩增过程，通过连接接头的马达蛋白将双链核酸解开，单链核酸分子穿过纳米蛋白孔道，根据不同碱基产生的不同电流信号推导出碱基信息，实现测序。

特点：可检测最长序列达4.2Mb，单孔测序平均速度可达450bp/s，建库过程无需片段化，测序不依赖PCR扩增，可实时进行碱基识别与分析，纳米孔芯片可反复使用，体积小巧、便携。

推荐意见：

病原样本具有生物安全隐患，推荐本地化开展病原微生物检测项目，纳米孔测序灵活性强，可即刻完成样本前处理及上机测序。

临床表现高度怀疑感染性疾病但病原不明、样本量较少且使用NGS开机成本高时，推荐使用纳米孔测序，能实现感染性病原微生物检测时效性与成本的平衡。

针对新发突发传染病疫情防控，需要基于全长基因组进行病原微生物演化和变异分析时，推荐使用较长读长的纳米孔测序进行病原微生物全长基因组检测和分子溯源。

对于需要区分高同源性的病原微生物亚型时，推荐使用较长读长的纳米孔测序以增加其特异性。

四、纳米孔测序的样本采集与运输保存

样本采集：

基本原则：尽量在患者入院当日或抗菌药物使用前采集样本，采集原发病灶部位的样本，严格无菌操作，避免污染。

不同样本的采集方法：包括血液、骨髓及其他高凝样本、呼吸道样本、脑脊液样本、胸腔积液等样本、脓肿样本、深部组织样本、房水/玻璃体液样本、粪便样本、菌液样本等。

样本运输及保存：

根据实际情况选择合适运输方式，若24h内送达可低温运输，24 - 72h内用干冰运输，怀疑高致病性或新发突发传染病应严格按相关法规要求包装及转运。

样本采集后应立即送检，若无法立即送检可暂存于4℃环境中（不超过7h）且当天送检，短期内不送检应置于 - 20℃以下冰箱暂存（不超过7d），长期保存应置于 - 80℃冰箱保存，RNA测序样本应直接置于 - 80℃冰箱保存，保存过程中应尽量避免反复冻融（一般不超过3次）。

五、检测过程

样本前处理：各实验室应建立标准操作流程，包括样本液化、浓缩及去除宿主等前处理方法，针对不同类型样本建立针对性程序，结合样本类型及应用方向综合考虑是否去除宿主细胞或核酸。

核酸提取：保证提取核酸的完整性和纯度，根据样本类型和微生物种类建立标准化提取程序，每次试验应包括内参、阴性对照和阳性对照，检测范围包括新发或未知病原时应将DNA和RNA分开提取。

核酸质量验证：建立合格核酸样本的标准，包括纯度、完整性及核酸含量，采用合适方法检测核酸完整性，使用Qubit荧光染料进行定量测定。

文库制备：将提取到的核酸进行修复后连接测序接头，明确不同连接方式的标准化操作步骤，根据起始核酸含量和应用方向决定是否进行PCR扩增和片段化处理，建库完成后及时上机检测。

文库质量验证：明确核酸质量及文库产出标准，采用Qubit荧光染料法检测文库浓度，根据应用方向和文库中核酸序列长度确定文库用量。

上机测序：纳米孔测序芯片保存、使用、质控应符合标准流程，依据样本类型及应用方向选择适合的数据量及测序时间等参数，监控测序指标，如过孔速度、测序质量、孔状态等，一般接头连接率应不低于90%，纳米孔利用率应不低于75%，序列过孔速度要求在300bp/s以上，测序质量值应>Q9，不满足要求应及时停止测序并补救。

六、生物信息学分析

序列拆分：构建测序文库时给每个样本加上测序标签，测序后通过识别标签区分样本。

接头及低质量序列过滤：使用Porechop软件过滤测序接头，使用NanoFilt、Filtlong等工具过滤测序序列，根据检测产品特点选择合适的最短读长阈值，平均测序质量值<Q7的序列将被整条过滤掉。

数据统计：使用NanoStats软件进行测序数据量统计，包括测序序列数、碱基数、序列长度分布、平均测序质量值等，数据量指标确定与应用方向、产品检测限及样本类型等因素有关。

参考数据库比对及物种鉴定：使用minimap2等软件将纳米孔测序的reads跟参考序列数据库进行比对，获得物种鉴定分类信息，选择高质量数据库并定期更新。

背景微生物过滤：构建背景数据库过滤污染序列，设置无模板对照样本监控背景微生物。

交叉污染判定：通过设计测试实验或加入内参序列等方式估算样本交叉污染比例，为结果解读提供参考。

物种注释：建立临床病原微生物的注释数据库，包括物种分类、致病性、定植信息、临床意义等。

七、报告解读

数据质控要求：不同应用方向检测范围不同，解读时应先确定是否满足样本质控要求，如数据量、片段长度、测序质量、内参含量等，不满足时应溯源排查。

阳性阈值及判读标准：各实验室应根据预期用途、样本类型、检测目标和技术特点建立并验证阳性阈值及判读标准，病毒检出少量特异序列可判为阳性，对于某些病原菌检出1条特异序列即可判为阳性，寄生虫应严格确认序列特异性后判读，新发物种不受阈值限制但需给出同源性比对结果，耐药基因分析应综合考虑抗性基因数据库等。

检测结果验证：应考虑序列在基因组上的覆盖度、特异性等因素，并通过交叉污染系数考察样本交叉污染情况，可通过PCR等方法对病原微生物进行验证。

无菌部位样本检出微生物种群的解读：无菌部位脓肿样本检出多种病原微生物共检出现象时，不应轻易视为污染，应给予抗菌药物全覆盖。

不可培养或难培养微生物的结果验证：这类微生物可通过核酸检测方法验证，如一代测序技术。

致病菌、定植菌和污染菌的判读：确定条件致病菌为病原菌时应综合考虑患者情况，出现大量背景菌或杂菌序列时应先考虑样本污染，外科手术或其他有创操作后的无菌部位样本应结合临床考虑，mNGS检测结果阴性应结合临床表现解读。

高度传染性微生物的处理要求：针对具有高度传染性的特殊病原微生物，实验室应制定特殊报告程序，检测结果应上报疾病预防控制中心，并尽快采用其他方法验证。

八、推荐意见

由于纳米孔测序读长较长，且采用PCR - free的测序过程，提高了原始样本的序列保真度，对于纳米孔测序检出reads较少的病原微生物，也应结合患者临床表现、病原微生物特性、样本类型及实验室环境等情况综合评估。

九、小结

本共识对纳米孔测序应用于病原微生物检测的各个流程进行规范建议，希望促进该技术的临床应用和良性发展。

纳米孔测序性能趋于优化与稳定，但进一步提升准确度、降低测序成本仍是主要挑战，未来在现场病原微生物检测等领域具有广阔应用前景。

十、附则

共识制定利益声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

共识更新计划：计划在2 - 3年间更新版本。

致谢：感谢浙江迪谱诊断技术有限公司张郁对本共识涉及的技术路线及方法验证所作的贡献。

专家共识原文件：