分子诊断技术是用于检测和分析疾病的分子基础。分子诊断技术包括聚合酶链反应 (PCR) 和实时 PCR (qPCR)、数字 PCR (dPCR)、荧光原位杂交 (FISH)、微阵列技术、基于质谱的蛋白质组学技术、蛋白质芯片、液体活检、生物传感器、单细胞分析等等。这些技术在临床诊断、个性化医疗、疾病监测和治疗效果评估中发挥着重要作用。随着技术的不断进步，分子诊断技术将进一步提升疾病的早期检测和精准医疗水平。

今天，为大家分享重庆医科大学附属第一医院临床分子医学检测中心程伟教授团队今年关于分子诊断新技术的临床应用前沿研究。

目前，原位 RNA 分析技术包括空间转录组测序、原位光学成像等。现有的 RNA 原位成像技术，主要依赖 RNA 直接触发后续复杂的核酸框架自组装，并结合报告探针生成高灵敏度的原位检测信号。尽管通过平行重复反应可以实现多重 RNA 分析，但传统策略极大地复杂了反应系统，且易受交叉干扰影响。

近日，重庆医科大学附属第一医院临床分子医学检测中心程伟教授团队与重庆医科大学检验医学院丁世家教授团队合作开发了一种基于 Cas9 编码关键系统的新型多重 RNA 原位成像技术，发表题为「Multiple RNA Rapid In Situ Imaging Based on Cas9 Code Key System」的研究，该研究发表在 Small Methods（IF:12.4）。

在这项研究中，研究团队创新性地提出利用精确的错配调控和 T-PAM 结构转换机制，构建了一个原始的关键探针（KP）编码器，并将其与 CRISPR/Cas9 信号输出器耦合，开发了一种新型的 Cas9 编码关键系统。示意图如下：

相比 Cas12 或 Cas13，CRISPR/Cas9 保留了对 PAM 结构的高度依赖性和精确的序列识别能力，且在面临信号输出问题时没有副切割活性。通过上述机制，多个靶标能够与对应的环识别区域特异性结合并解离，触发 KP 编码器的解构重组，形成编码产物。这些不同的编码产物具有相同的 sgRNA 靶向序列，因此只需单个 sgRNA/Cas9 复合物即可实现多对一的串联信号编码。此外，Cas9 编码关键系统可与 T 链置换扩增（T-SDA）信号放大元件结合，构建一个高效、特异和敏感的多重 RNA 快速原位成像系统，可将该系统应用于肿瘤细胞和临床病理切片，仅需一步即可在不到一小时内生成清晰的多 mRNA 成像图谱。

该研究具体如下：

01 基于错配调制的 Cas9 编码密钥系统的信号输出机制

CRISPR/Cas9 系统中 Cas9 蛋白在靶点激活后不具有有效的副切割活性，无法切割 F-Q 荧光信标以生成信号。因此，以 CRISPR/Cas9 系统为主导的 Cas9 编码关键系统的主要问题在于设计一种不依赖副切割活性的信号输出系统。

如图 1 所示，在经典的 CRISPR/Cas9 系统中，sgRNA/Cas9 复合物由 PAM 模体引导切割靶向的双链序列 P，产生一个稳定的双链 DNA 产物。该双链 DNA 产物具有高 Tm 值，不能自由解离以释放荧光信号。

研究团队通过引入错配碱基，来降低结合熵值。在 P 探针的非识别序列中掺入 N 个错配碱基，在未切割的条件下，P 探针保持稳定结合状态。被切割后，由于存在错配碱基，双链 DNA 产物序列以低于常规反应温度（37 °C）的 Tm 值自主解离，从而释放荧光信号。以此，成功构建了一个不依赖副切割活性的 Cas9 信号输出系统。

02 基于 T-PAM 结构转变的 Cas9 编码关键系统信号激活机制

Cas9 编码关键系统的信号通路简单总结如下：靶标结合触发 KP 编码器中 T 框架和 PAM（T-PAM）的空间结构转变，导致 Cas9 级联激活，通过切割产生输出信号。

所以，PAM 结构的调节对于 Cas9 代码关键系统实现靶响应激活至关重要。在 KP 编码器结构中，PAM 的位置是最大化空间阻挡效应的主要因素。因此，重点优化了 PAM 序列在 KP 编码器的结构区域位置、不同的 PAM 序列，以实现精确控制 T-PAM 结构的稳定性和触发效率，优化了编码关键系统的性能。

03 探索 Cas9 编码关键系统的结构和反应动力学

研究者进一步优化了环编码识别区的碱基数目、 sgRNA 识别区中不匹配碱基数目，以获得 Cas9 编码关键系统的最佳分析性能。

为了增加 KP 编码器结构组装的稳定性，优化了一系列参数，如 L/P1/P2 的浓度比、退火方式和退火时使用的 Mg²⁺ 浓度。在稳固的 KP 编码器结构基础上，进一步研究了 Cas9 编码关键系统的最佳反应条件及其反应动力学。

04 Cas9 编码关键多重检测系统的建立和性能验证

Cas9 编码关键多重检测系统依赖于 KP 编码器的环编码识别区和 T-PAM 结构转换来实现多重目标信号的识别编码和转换输出。

研究者建立了 3 个 KP 编码器，它们共享相同的 sgRNA 靶向序列，唯一的区别在于环识别区序列和标记在 P 探针末端的荧光基团。

首先验证了 Cas9 编码在单一系统内实现多重目标检测的可行性，三个编码链最终生成了相应强烈的荧光信号，且单个系统内多个目标之间的信号互不干扰。

随后，在最佳反应条件下混合不同浓度梯度的编码链，进行定量分析，初步探索 Cas9 代码密钥多重检测系统的分析性能。结果证明 Cas9 编码密钥多重检测信号在不同浓度梯度表现出优异的可靠性。

05 基于 Cas9 编码关键系统的多 RNA 快速原位成像策略构建

虽然 Cas9 蛋白酶缺乏副切割活性有助于构建多重检测系统，但同时也失去了自我信号放大的能力，因此在分析极低丰度的肿瘤 RNA 靶标时，其灵敏度仍然不够。

研究者引入了两个引物 TP 链，与靶向 RNA 形成一个有切口的 T 结构，然后在酶的作用下，触发高效的 SDA 信号放大，生成大量重复的信号链。这些信号链随后与 Cas9 编码关键系统的多重检测系统耦合，最终构建了一种新型的基于 Cas9 编码关键系统的多 RNA 快速原位成像系统。

随后，研究者选择乳腺癌细胞作为分析模型，选择 HER2、孕激素受体（PR）和雌激素受体（ER）mRNA 作为乳腺癌分子分型指标，用于多重检测。验证了其可行性，并证实了 Cas9 编码关键系统系统具有可靠分析多个 mRNA 的能力，并进一步研究了该系统的最佳反应时间。

且通过细胞模型验证了该系统的原位多重成像性能，充分证明该多 RNA 原位成像系统具备原位多个 mRNA 成像分析能力。

06 多 RNA 快速原位成像系统的临床样本验证

研究者收集了临床乳腺癌患者的福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织切片样本，进行 HER2、PR 和 ER mRNA 的原位成像分析。基于 Cas9 编码关键的多 RNA 原位成像系统可以在不到 1 小时内实现快速的多 RNA 原位成像。

并通过临床 IHC/FISH 明确诊断的 FFPE 样本来验证该系统的成像效果。结果表明，研究团队构建的多 RNA 原位成像系统能够在单个 FFPE 样本中同时实现 3 个 mRNA 的清晰成像，并与临床分级诊断结果高度一致。

在此基础上，进行了大样本的临床比较分析，收集了 20 个不同临床乳腺癌表型的 FFPE 样本，使用基于 Cas9 编码关键系统进行多 mRNA 成像，并与临床 IHC/FISH 分级结果进行比较。相关性分析显示，IHC/FISH 分级与基于 Cas9 编码关键多 RNA 原位成像系统的定量荧光成像结果之间存在显著相关性。确认了基于 Cas9 编码关键的多 mRNA 原位成像分析系统与临床分型诊断高度一致。

结语

该研究提出的 Cas9 编码关键系统通过巧妙的错配调调节和 T-PAM 结构转变机制，成功解决了传统多重 RNA 原位成像策略的复杂性和低效性问题。通过构建统一的编码产物，实现了高效的 「多对一」 串联信号传递，大大简化了多重检测系统的设计和操作。此外，将该系统与 T-SDA 信号放大器结合，开发了一种快速的多重 RNA 原位成像平台，为临床肿瘤分型和分子机制研究提供了可靠的技术支持。且研究者将其成功应用于实际的肿瘤组织检测中，展现了该技术广阔的应用前景。

参考文献：

[1] Hu R, Yang W, Li J, Jiang L, et al. Multiple RNA Rapid In Situ Imaging Based on Cas9 Code Key System. Small Methods. 2024 May 3:e2400195. doi: 10.1002/smtd.202400195. Epub ahead of print. PMID: 38699929.