15分钟, 超灵敏单步CRISPR检测

近日，杂志Nature Communications上发表了一篇题为“Ultrasensitive single-step CRISPR detection of monkeypox virus in minutes with a vestpocket diagnostic device”的文章。作者     开发了一种使用袖珍装置的RPA-CRISPR/Cas13a诊断系统SCOPE，用于在15分钟内对皮疹液拭子、口腔拭子、唾液和尿液样本中的MPXV进行即时检测，该方法可以识别低至0.5拷贝/µL(2.5拷贝/反应)的病毒DNA。102份临床样本的检测结果与qPCR相比，具有100%的灵敏度和特异性。SCOPE显示出在资源有限的环境中使用的潜力，可以大大提高MPXV的诊断能力。

作者开发了一种快速、超灵敏、可现场部署的CRISPR/Cas13a诊断系统SCOPE (Streamlined CRISPR On Pod Evaluation platform)，用于在皮疹液拭子、口腔拭子、唾液和尿液样本中进行MPXV的即时检测。收集的样品进行2分钟病毒裂解处理，然后进行10分钟单步RPA-CRISPR/Cas13a反应。整个过程均在袖珍CPod中进行。用户只需要将采集到的样品装入裂解缓冲液中，并将裂解样品转移到单步CRISPR反应系统中。SCOPE可以在资源有限的情况下在15分钟内检测到MPXV，减少了操作时间和液体处理步骤。

单步CRISPR检测将RPA、T7转录和CRISPR/Cas13a检测在单管中进行，避免了气溶胶污染。通过RPA扩增裂解的MPXV DNA，扩增子被T7 RNA聚合酶转录成单链RNA，RNA产物被Cas13a和crRNA复合物识别，并激活荧光报告基因（图a）。

对于单步CRISPR反应，引物和crRNA的筛选显著决定了检测灵敏度。作者筛选了16组RPA引物，以及3种不同的靶向MPXV F3L基因的crRNA，并进行检测。结果显示次优引物(F3-R1)和次优crRNA (crRNA-3)的组合效果最好。此外，优化结果表明，rNTP混合物浓度为1 mM、T7 RNA聚合酶浓度为1 U/uL、引物浓度为500 nM、LwaCas13a浓度为50 nM、crRNA浓度为100 nM、RNase H浓度为0.05 U/µL时表现最佳(图b-g)。

系统优化无提取病毒灭活裂解工艺，释放MPXV样品的核酸，简化样品预处理工作流程。根据世卫组织的说法，最好的诊断标本是直接从皮疹(皮肤、液体或结痂)上取的拭子，也可选择口咽、肛门或直肠拭子，不建议进行血液检查。温度和时间是病毒裂解的两个关键参数。最终选择了80℃孵育2 min作为最佳裂解条件。此外还确定了裂解缓冲液与样品的最佳比例为皮疹液拭子为9:1，口腔拭子为3:1，唾液为1:3，尿液为9:1，且使用7µL的裂解样品时反应效率最佳。直接裂解法对皮疹液拭子、口腔拭子和唾液标本的核酸提取结果与传统的核酸提取方法相似(图t-v)，但由于尿样成分复杂，裂解效果明显低于核酸提取(图w)。

设计并制造了一种小型化、低成本、用户友好且多功能的自制设备，以适应上述基于CRISPR的检测实验(图a,b)。金属陶瓷加热器和PT1000温度传感器由ESP32微控制单元进行控制。此外，在裂解温度(80°C)至CRISPR反应温度(37°C)时，增加了冷却风扇以加快冷却速度。在CPod中使用了低成本，微小且敏感的光谱传感器AS7341，集成了8个可见光通道和1个近红外光谱通道，可以满足多路检测的要求。最终诊断可以以两种不同的模式呈现，对于独立模式(易于使用模式)，可以通过指示灯通过肉眼读取结果。对于无线控制模式(专业模式)，CPod与智能手机无线连接，收集的实时荧光强度可以在内部设计的智能手机应用中显示。整个CPod由USB Type-C电源适配器供电。光学，机械和电子组件的总成本为13.46美元。由于它不需要任何外部设备，是一种灵活和通用的解决方案，以满足日益增长的分子诊断需求。这种小型化、简单易用、低成本的设备在基层医疗机构中具有很大的应用前景。

病毒核酸的检出限(LoD)对于早期筛查至关重要。作者分别在CPod和荧光酶标仪上测试单步RPA-CRISPR/Cas13a检测方法的LoD (图a-c)。CPod测得的LoD为0.5 copies/µL (2.5 copies/reaction)，与酶标仪测得的LoD一致。几种正痘病毒和其他类似症状的病毒，包括牛痘、天花、单纯疱疹病毒(HSV)和水痘，经MPXV检测验证无交叉反应性(图f)，从而表明此检测系统具有良好的特异性。

为了研究SCOPE的临床适用性，作者收集了102份临床样本，包括35份Mpox阳性样本(9份皮疹液拭子样本、9份口腔拭子样本、9份唾液样本和8份尿液样本)，19份HSV样本(5份皮疹液拭子样本、5份口腔拭子样本、4份唾液样本和5份尿液样本)，以及48份健康男性阴性样本(12份皮疹液拭子样本、12份口腔拭子样本、12份唾液样本，以及12份尿液样本)，并与qPCR法并排进行SCOPE检测。提取病毒的qPCR总共花了将近2小时，而基于SCOPE的病毒裂解只花了15分钟。qPCR检测MPXV阳性样本的Ct值范围为15.88 ~ 39.02。SCOPE以100%的灵敏度和100%的特异性正确识别了所有102例临床样本(图c)，与qPCR结果100%一致(图d, e)，表明本文提出的SCOPE用于MPXV检测与金标准qPCR相比具有竞争力的检测性能，但反应速度更快，用户操作更少，现场可部署能力更强。

最近爆发的COVID-19和Mpox等传染病流行突出了快速、敏感、准确的核酸POCT技术在家庭自检或现场流行监测中的必要性和重要性。新兴的CRISPR-Dx检测技术具有实现这一目标的巨大潜力。然而，大多数现有的CRISPR- dx检测方法使用核酸预扩增和CRISPR反式切割两步检测，这可能导致复杂的工作流程和气溶胶污染的风险。本研究开发了一种低成本的基于CRISPR的POCT平台，采用一种简化的病毒裂解方法，可在2 min内快速有效地从样本中释放核酸。CPod可以执行所有检测程序，而无需使用任何额外的仪器。在从样品输入15分钟内检测到低至0.5拷贝/µL(2.5拷贝/反应)的MPXV，其检测性能与qPCR相当，但速度更快，工作流程简化，现场可部署能力更强。

一些进一步的改进可以使之更适用于护理点的需求。在目前的工作流程中，需要80°C加热2 min才能释放病毒核酸。应优化裂解缓冲液和反应时间，以在室温下实现高效的病毒裂解。此外，可以设计一种“进样、出样”的微流控芯片，将样品裂解、溶液转移和RPA-CRISPR反应完全集成在一起。此外，该分析仅使用从男性患者收集的样本进行了验证，因此还需要大量临床验证。总之，SCOPE将成为MPXV或其他病原体即时检测的有力工具。这种快速、超灵敏的单步RPA-CRISPR检测可以很容易地与当前基于Cas13a的技术相结合，促进CRISPR-Dx领域的实质性进展。