小罗开讲 | tNGS技术在呼吸道病原检测中的应用

感染性疾病面临着几个重要挑战^【2】：首先是新旧传染病的新发及再现，其次是抗微生物药物的耐药性问题日益严重，最后是感染性疾病的检测技术亟待革新，尤其需要专业人才进行检测结果的分析。面对这些挑战，传统的病原微生物检测手段，如形态学、分离培养以及鉴定已不能完全满足临床需求。宏基因组测序(metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS)技术通过检测所有生物遗传物质的总和，实现了广泛覆盖、无偏倚和无需培养的临床标本检测^【3】。它在探索微生物未知领域方面取得了重要突破，能够一次性检测标本中的所有微生物。mNGS在疑难危重感染、新发罕见病原感染、混合感染等困难模式中也逐渐改变了临床感染的检测与分析模式。随着病毒基因组中的抗性基因数量不断增加，加上测序成本的不断降低以及持续累积的传播链测序数据，促进了mNGS在病原检测与分析中的兴起。

随着病原测序数据的逐渐积累，越来越多研究人员开始依托感染大数据来开发针对不同标本类型病原谱的更适合临床研究分析的NGS路径，即靶向测序（target Next-Generation Sequencing，tNGS）产品。tNGS的主要技术路线是直接对临床样本中的目标核酸进行富集，通过多重PCR扩增或探针杂交液相捕获技术来靶向富集目标病原^【3】，可以在排除宿主核酸干扰的同时提升检测灵敏度。测序方法的选择根据应用场景而不同，主要考虑因素包括检测分析的敏感性、特异性、准确性、成本和可扩展性等^【4】。

在2023年发布的《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识》中，病原体高通量测序技术在临床应用的共识度高达98.8%^【5】，对于上呼吸道感染、气管支气管炎、肺炎、肺结核及结核胸膜炎等都提供了mNGS和tNGS检测的指导意见。二代测序技术也逐渐在临床病原检测中发挥重要作用。

tNGS的产品设计有两个主要方向，第一种是以症候群为核心进行靶向捕获测序，例如针对上呼吸道感染常见几十种病原、或针对中枢神经系统感染的上百种病原等。这类捕获方案可以在为病原鉴定提供证据的同时，检出潜在的耐药基因或毒力基因。以2023年11月一项儿童呼吸道病原体检测的研究为例^【6】，研究人员使用传统培养和抗菌药物敏感性测试 (AST) 作为金标准，评估了tNGS在47份儿童支气管肺泡灌洗液 (BALF) 样本中检测呼吸道病原体及耐药基因（ARG）的性能。tNGS结果不仅能够检测难培养的病原及细菌/病毒双重感染，提供了84.4%的检出敏感性和97.7%的检出特异性，还同时鉴定出四环素、β-内酰胺、磺酰胺等相关耐药基因。这些结果对多种难以培养的病原检测以及耐药性预测等方面表现出优越性，对于病原菌感染的准确检测和指导临床治疗具有重要意义。

另外一种思路则是对单一流行性病原体的靶向捕获，例如新型冠状病毒靶向测序、诺如病毒靶向测序等。这些病原体载量低、变异快、传播途径广，可以通过tNGS技术进行分子分型、病原溯源及流行病学研究。自2019年新型冠状病毒被发现进入人类社会以来，于2020年9月有了谱系的第一次重大分化，即后来被命名为VOC的Alpha、Beta和Gamma，分别在世界不同地区独立出现。相对于它们的祖先谱系，Alpha和Gamma变异株分别新增了14个和11个非同义突变，而后来的Omicron又仅在S基因上就增加了几十个突变，不同亚型的分支也在逐渐变异^【7】。tNGS技术由于可以在排除宿主核酸干扰的同时提升检测灵敏度，这为新冠病毒的进化特点、系统发育模式及流行病学研究提供了高效助力。以2022年发表在Viruses的研究为例^【8】，研究人员分别对鼻咽拭子或支气管肺泡灌洗液的新冠（SARS-CoV-2）阳性样本中分别进行了mNGS和tNGS测序。mNGS测到的大部分（93.45%）序列都来自人类基因组，只有不到1%的数据量可以用于病毒分析。而经过靶向富集后的tNGS结果则有超过 83.03% 的目标序列都来自病毒，能够覆盖基因组的90%以上。该研究采用罗氏的靶向富集探针及KAPA HyperCap靶向捕获工作流程，tNGS测序结果大大提高了测序效率，为病原的检出和分子分型提供了依据。

1. 国家卫生健康委1月14日新闻发布会

2. 杨娟, et al. 感染性疾病流行现状, 防控挑战与应对[J]. 中华疾病控制杂志, 2017, 21(7): 647-649.

3. Pronyk, Paul Michael, et al. Advancing pathogen genomics in resource-limited settings. Cell Genomics (2023).

4. Houldcroft, Charlotte J., Mathew A. Beale, and Judith Breuer. Clinical and biological insights from viral genome sequencing. Nature Reviews Microbiology 15.3 (2017): 183-192.

5. 中华检验医学培训工程专家委员会等. "成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临用应用专家共识(2023)." 协和医学杂志 14.5(2023):959-971.

6. Lin, R, et al. Performance of targeted next-generation sequencing in the detection of respiratory pathogens and antimicrobial resistance genes for children. Journal of Medical Microbiology 72.11 (2023): 001771.

7. Ghafari, Mahan, et al. Purifying selection determines the short-term time dependency of evolutionary rates in SARS-CoV-2 and pH1N1 influenza. Molecular Biology and Evolution 39.2 (2022): msac009.

8. Pogka, Vasiliki, et al. Targeted Virome Sequencing Enhances Unbiased Detection and Genome Assembly of Known and Emerging Viruses—The Example of SARS-CoV-2. Viruses 14.6 (2022): 1272.