《养殖场非洲猪瘟病毒弱毒株防控技术指南》的使用说明

    “为做好非洲猪瘟防控工作，指导养殖场及时发现非洲猪瘟弱毒株，提升防控能力，中国动物疫病预防控制中心发布了《养殖场非洲猪瘟病毒弱毒株防控技术指南》”。类似的指南每年都会发布，但是这个指南里在技术环节还是比以往有了很大的进步。借着这个指南，我也会在文中探讨一下非洲猪瘟病毒弱毒株的检测。

一、非洲猪瘟弱毒株

    原博士在“非洲猪瘟检测大事记”中详细记录了非洲猪瘟2018 年8 月1 日在我国首次报道到各种变异株出现的事件。弱毒株大体分为三类：病毒本身的自然致弱毒株；国外的疫苗株如西班牙研制失败的非洲猪瘟1型NH/P68和OURT88/3株，越南批准的ASFV I177L基因缺失株疫苗；以及各种“科技与狠活”造就的弱毒株，这类毒株含有各种如CD2v、MGF等基因的缺失以及荧光素标签如EGFP、mCherry。

二、检测方法

    “病原检测方法：可采用非洲猪瘟病毒(P72/CD2v/MGF)、非洲猪瘟病毒(P72/EGFP/mCherry)、非洲猪瘟病毒(P72/X64R/MGF360-14L)等三重荧光PCR方法检测病毒核酸。必要时，需要对部分病毒基因进行序列测定，如EP402R基因。对非常见基因变异且临床症状特殊病例，需进行全基因组测序鉴别。抗体检测方法：采用经批准的间接ELISA、阻断ELISA等方法或胶体金试纸条。”

    对于如此复杂的弱毒株，针对某几个基因进行检测已经意义不大，大部分检测机构只需要针对非洲猪瘟p72基因进行荧光定量PCR检测即可，对于部分有研究需要的科研机构可以使用高通量测序的方法对非洲猪瘟病毒进行全基因组的测序。

    大家需要注意的是胶体金试纸条推荐使用的场景是抗体检测，今天有人问我能否将其用于病毒抗原检测，我的回答是对于病原检测免疫学方法比核酸检测方法灵敏度低1000倍，能不能用，大家自己选择。

三、核酸与抗体检测

“定期开展场外环境检测，每周对场内门把手、风机、料槽等高风险点进行病毒核酸检测。

定期抽样监测母猪群及育肥群的病毒抗体情况，高风险期要考虑对母猪全群进行病毒抗体监测。

母猪分娩后，采集脐带血、胎衣或胎衣液等样品以及母猪深咽部拭子联合尾根血混样，进行病毒核酸检测。

临床发现异常猪只，要立即逐头对母猪群进行病毒核酸和抗体检测；对育肥群开展棉绳口腔液采样，进行病毒核酸检测。

对于病死猪，在确保养殖场内生物安全的情况下，采集淋巴结、肺脏等样品及时检测病毒核酸。

此外，猪群进行常规疫苗接种、转群、去势等生产操作后，要抽样检测非洲猪瘟病毒核酸。”

    核酸检测目前仍然是非洲猪瘟检测的金标准，因此需要日常对环境、各类血液、组织、口腔液等样品进行核酸检测。同时为了确保发病猪能被检出，还需要使用抗体检测。

1.非洲猪瘟的核酸检测

    很多人都反映病毒变弱了，病毒越来越难检测出来了。病毒变弱病毒载量降低导致检测难度加大，这时需要选择灵敏度更高的试剂，提升实验室检测能力使检测系统更加灵敏和稳健。目前的情况是检测实验室选择更便宜的试剂，试剂公司使用更便宜的原料，产品性能在绝对低价面前甘拜下风。整个行业在低质低价中陷入了“死亡漩涡”。核酸检测试剂我们除了需要经济实惠的非洲猪瘟核酸检测试剂，还需要抗干扰、灵敏度高、反应快速、以及支持冻干、全预混、多重、防污染等等各种性能的多元化高品质试剂。

2.非洲猪瘟的抗体检测

   目前对于非洲猪瘟的检测需要核酸和抗体同时进行，不管是核酸还是抗体检测，只要有一个结果呈阳性，就应该被视为是感染的阳性猪。ELISA方法仍然是目前最主流的检测方法。需要注意的是所有的ELISA试剂盒都有假阳性和假阴性的问题，如果想进行抗体阳性样品的确诊需要使用间接免疫荧光等金标准方法。

非瘟抗体ELISA检测知识点梳理

原博士谈非洲猪瘟病毒抗体检测（采访汇编）

3.抽样数量

检测所需采样量，如果进行进行群体监测以获得估计流行率需要使用预估期望值/估计流行率抽样计算公式，详见：

如何科学计算动物疫病检测所需采样量？

 预估期望值/估计流行率抽样计算公式为：

n：需要的抽样数量；

Z：Z分布的置信水平，通常取置信水平CL为95%，Z为1.96;

p：预期流行率；

q：1-p；

L：精密度或可接受误差，也可e表示。

四、科学采样

    “采用深咽拭子联合尾根血混样，或口鼻拭子联合腹股沟淋巴结穿刺混样的采样方法，可提高病原检出率。对临床异常猪，要同时采集前腔静脉血、尾静脉血或耳缘静脉血，进行病毒抗体检测。采样要使用聚丙烯材质拭子，避免使用头部为棉花制品的拭子、含海藻酸钙拭子以及木柄拭子，防止棉花纤维对蛋白质吸附影响病毒洗脱效果及抑制PCR反应的物质影响检测结果。

    样品保存应使用无菌、对核酸无吸附作用的螺旋盖塑料管。每个样品管应再套一个样品袋防止样品泄露和污染。新采集的临床样品应在2～8℃下保存，采集后2～4小时内送至实验室。用于核酸检测的样品应当尽快进行检测，能在24小时内检测的样品可置于4℃保存；24小时内无法检测的样品应置于-70℃或以下保存(如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存)。”

   关于采样拭子的材质我在“病毒采样拭子的评估试验初探”中进行了详细的实验，植绒拭子在病毒释放率和稳定性上均优于棉拭子等其他材质的拭子。植绒拭子配合核酸保护液才能发挥最大的作用，病毒在唾液和环境样品中很快就会降解，应该建议植绒拭子配合含胍盐等灭活型保存液共同使用。

五、质量控制

    “要强化检测人员技术能力，定期开展培训和考核。要定期检测PCR仪、荧光定量PCR仪等设备运行能力，及时维护保养。要定期参加实验室间能力比对，日常使用标准物质或标准样品进行检测质控。

    要规范实验操作，避免病毒污染。对样品接收及处理间、试剂准备间、核酸提取和扩增间等区域以及门把手、传递窗、试验台等高风险位置应定期采样检测。实验结束后，立即清洁工作区，使用消毒液对桌面、地面、生物安全柜等进行消毒，对操作间进行紫外线照射消毒，妥善储存开封试剂和耗材。”

    虽然不系统，但是终于在非洲猪瘟相关的技术方案中看到质量控制的内容了，这是很大的进步。质量控制还是从性能验证、室内质控、和室间质评三个方面来进行。但是具体怎么做，谁来组织没有规定详细，这部分可参照《新冠肺炎实验室检测技术指南》：

    “性能验证。临床标本检测前，实验室应对核酸提取试剂、提取仪、扩增试剂、扩增仪等组成的检测系统进行必要的性能验证，性能指标包括但不限于精密度（至少要有重复性）和最低检测限。建议选用高灵敏的试剂（检测限≤500拷贝 /ml）

    室内质控。每批检测至少有1 份弱阳性质控品（第三方质控品，通常为检出限的 1.5-3 倍）、3 份阴性质控品（生理盐水）。质控品随机放在临床标本中，参与从提取到扩增的全过程。

    室间质评。实验室应常态化参加国家级或省级疾控机构组织的室间质评。”

《新冠肺炎实验室检测技术指南》的演化解析（三）实验室检测

    实验室污染的处理重在预防和早发现，实验室污染风险最高的部位在样品处理的移液器、组织研磨液、冰箱、生物安全柜、以及台面和门把手。

可参照：

PCR实验室的44个风险监测点

如何预防和处理PCR检测实验室的核酸污染？

案例分享：当PCR实验室发生污染时该怎么做？

六、生物安全

很遗憾，这里说的生物安全其实是猪场的生物安全而非检测的生物安全。应该强调一下农业部对于非洲猪瘟检测的要求。

“从事非洲猪瘟病毒相关实验活动的实验室应当具备相应生物安全防护水平。从事非洲猪瘟病毒分离和鉴定、活病毒培养等实验活动的，应当在生物安全三级、四级实验室进行。从事动物接种（感染）试验等实验活动的，应当在具备中型及以上实验动物条件的生物安全三级、四级实验室进行。

各省级畜牧兽医主管部门要对辖区内从事非洲猪瘟检测的实验室全面开展生物安全检查。主要检查内容包括：一是开展检测活动的实验室是否经省级畜牧兽医主管部门批准，具备相应设施设备和专业技术人员，管理体系健全，近三年内未发生任何生物安全事故，具有生物安全二级或以上的实验室生物安全防护水平。二是实验室活动是否严格遵守实验室生物安全操作规范。是否按要求做好样品检测前的处理和灭活，检测结束后废弃物的消毒和无害化处理，相关物品和设备设施的清洗消毒，以及剩余样品的销毁等无害化处理。三是实验室检测结果是否按规定及时上报。对于发现的疑似阳性结果，是否立即报告所在地省级动物疫病预防控制机构，并反馈送样单位。  ”

    一名技术人员最无助的时刻就是明明发现这里出了问题，但是技术却解决不了这个问题。今天看到这个指南想到了很多人、很多事，有感而发！