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患者因 「发热皮疹伴痛 7 天，呼吸困难半天」 入院，外院血培养单份检出铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA），高度怀疑皮肤源性，导致感染血流播散。入院前有抗生素应用史，具体不明。因病情严重转 ICU 治疗，入院予强心升压、气管插管和 CRRT 治疗。予泰能（亚胺培南西司他丁）1000 mg iv drip Q8H + 斯沃（利奈唑胺）300 mL iv dri Q12H+ 可乐必妥（左氧氟沙星）0.5 g po qd 抗感染治疗，并留取皮肤伤口细菌培养。次日伤口培养鉴定为铜绿假单胞菌。药敏实验（Vitek 2 Compact）结果如下：头孢菌素类：头孢他啶 2 S，头孢吡肟 2 S； 青霉素酶抑制剂类：头孢哌酮 / 舒巴坦 ≤ 8 S，哌拉西林 / 他唑巴坦 8 S，替卡西林 / 棒酸 16 S； 头霉素类：氨曲南 4 S； 碳青霉烯类：亚胺培南 2 S，美罗培南 ≤ 0.25 S； 喹诺酮类：环丙沙星 ≤ 0.25 S，左氧氟沙星 0.25 S； 氨基糖苷类：丁胺卡那霉素 ≤ 2 S，妥布霉素 ≤ 1 S； 粘菌素类：多粘菌素 E ≤ 0.5 S。
对常用抗生素均高度敏感！根据药敏结果改用美平（美罗培南）2 g iv drip Q8H 抗感染治疗。患者在第三天病情加重，出现严重脓毒血症和感染性休克，经积极抢救无效死亡。大家会疑问，从药敏谱看，患者伤口培养的铜绿假单胞菌对多种临床常用的抗生素（包括美罗培南）高度敏感。但是为何抗感染疗效不佳？患者感染源为皮肤感染，但其皮损面积大，程度深。皮肤作为人体第一道免疫屏障遭到严重破坏，免疫功能严重受损。患者皮肤伤口培养鉴定为铜绿假单胞菌，高度怀疑皮肤源性，导致细菌入血。局部细菌数量大，细菌生长速度快，导致病情迅速恶化。根据近年来我国流行病学统计数据，铜绿假单胞菌对美罗培南的 MIC 值优于亚胺培南。然而患者感染难以控制甚至出现感染性休克，提示传统经验用药收效不佳，是否存在其他潜在的耐药机制影响抗感染治疗？铜绿假单胞菌主要感染基础情况差、长期住院、使用广谱抗生素、接受侵入性诊疗操作及各种免疫力低下的患者。近年来，多重耐药的铜绿假单胞菌层出不穷，往往导致患者严重感染常难以治愈且临床致死率极高。为找到抗感染失败的背后真相，随后进行了纸片扩散法（KB 法）药敏试验，令人惊讶的是美罗培南的抑菌圈中有散在的菌落生长（已排除操作污染），难道是抑菌圈中的细菌影响临床抗感染治疗？文献报道，抑菌圈中有菌落生长的现象是异质性耐药（heteroresistance）的表现。异质性耐药即具有相同遗传背景的单克隆菌群中存在对抗菌药物敏感性不同的亚群，主要表现为纸片扩散法或 E-test 的抑菌圈中有菌落生长或进行微量肉汤稀释法时出现 「跳孔」 现象。案例中正是铜绿假单胞菌对美罗培南异质性耐药。随后，进行微量肉汤稀释法对异质性耐药做进一步验证，结果如下。注：同一菌株进行微量肉汤稀释法药敏试验，在美罗培南浓度为 2-4μg/mL 时，超过 80% 细菌能被完全抑制，然而美罗培南浓度为 24μg/mL 时，部分耐药亚群快速增长。（即跳孔）
正是由于异质性耐药，这部分耐药亚群的漏检导致了临床抗感染治疗的失败。至此，也揪出了案例中罪魁祸首的「行凶」方式。为什么药敏报告显示铜绿假单胞菌对美罗培南敏感，而纸片扩散确并非如此？由于目前临床微生物室大多使用梅里埃 Vitek 2 Compact 全自动细菌分析仪进行药物敏感性试验以监测细菌耐药情况。然而，自动化仪器只能检测到快速增长的耐药菌群（药敏呈现为耐药 R），无法检测异质性耐药细菌中小部分耐药亚群的生长。我们推测在一定时间内这些耐药亚群的生长可能不足以引起能被仪器捕获的浊度变化。因此，在临床中异质性耐药细菌往往不易被常规实验检出。1、纸片扩散法或 E-test 的抑菌圈检测是否有菌落生长。2、群体谱分析法（ PAP）被认为是异质性耐药检测的金标准。PAP 可提供耐药亚群频率和 MIC 等信息，但过程相对繁琐。主要分为涂板法与点样法两种。涂板法：将过夜培养的菌液调节至 107CFU/mL，取 20 µL 涂布于梯度抗生素（具体浓度根据细菌 MIC 而定）平板上，37℃孵育 48 h 后观察平板。耐药亚群的耐药水平（最低完全抑制浓度与最高完全不抑制浓度的倍数）大于 8 倍，判定为异质性耐药。 点样法：将过夜培养的菌液调节至 107CFU/mL，取 10 µL 点样于梯度抗生素（具体浓度根据细菌 MIC 而定）平板上，37℃孵育 48 h 后观察平板。耐药亚群的耐药水平（最低完全抑制浓度与最高完全不抑制浓度的倍数）大于 8 倍，判定为异质性耐药。
最新文献报道 KB 法 /E-test 筛查异质性耐药与 PAP 的符合率较低，建议临床试验中直接采用 PAP 检测异质性耐药。回到案例中，不难解释为何应用美罗培南后细菌感染仍然加重，除了患者免疫力降低，炎症发展快速和细菌大量增殖，亟需思考选用的抗生素是否恰当。已有大量研究已经报道铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素异质性耐药。对于碳青霉烯类异质性耐药的铜绿假单胞菌，其治疗方案主要包括两种：①换用无异质耐药性的抗生素，以较低的剂量达到抗菌目的。②联合用药，利用协同效应达到治疗效果。在临床工作中，异质性耐药细菌不易被常规实验检出。细菌异质性耐药现象广泛存在于金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和结核分枝杆菌等多种病原菌中。对于这些临床常见的高风险病原菌，检验科应发挥其专业能力 , 一方面要加强临床工作中异质性耐药细菌的监测，另一方面应加强临床沟通，与临床密切配合，指导临床合理用药。仅以此病例提醒各位临床医生和检验人在今后的临床工作中需要多加注意，尤其在药敏证据和临床病程进展不一致时，及时检验是否存在异质性耐药菌。[1] Oikonomou O, Panopoulou M, Ikonomidis A. Investigation of carbapenem heteroresistance among different sequence types of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates reveals further diversity[J]. J Med Microbiol, 2011, 60(Pt 10): 1556-1558.[2] He J, Jia X, Yang S, et al. Heteroresistance to carbapenems in invasive Pseudomonas aeruginosa infections[J]. Int J Antimicrob Agents, 2018, 51(3): 413-421.[3] El-Halfawy OM, Valvano MA. Antimicrobial Heteroresistance: an Emerging Field in Need of Clarity[J]. Clin Microbiol Rev, 2015, 28(1): 191-207.
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