【冯仁丰】血清蛋白标准化系列 3 什么是CRM470 2

五、以往建立的参考物质介绍

（1）1967年，Rowe等制备了一批血清，作为第一个血浆蛋白-免疫球蛋白的国际标准。这批混合血清的一部分，被命名为批号67/86，成为WHO免疫球蛋白标准，分装于安瓿，在伦敦的国家生物标准和控制品研究院冻干。余下一部分，在英国的Beckenham的Welcome Research Laboratories用稍有不同的程序处理，以后成为67/95、67/97、67/99批。67/86批被定义为：每安瓿内含有三种免疫球蛋白各100单位（U），这应是具有国际单位（IU）的免疫球蛋白的一级参考物质。67/95和67/97批的蛋白值与第一批（67/86）作直接比较确定，检测方法为放射免疫扩散试验。67/99的值又是67/99和67/86安瓿含量经加权平均值比较确定。这三批为二级参考物质。由10个专家实验室使用免疫化学方法，相对于纯化蛋白对67/86一级参考物质的IgG、IgA、IgM确定质量值。因实验室间过大的变异，取均值确定。

（2）1973年，WHO和国际免疫组织联合会（International Union of Immunological Society）建议形成一个新的明确的稳定的冻干人混合血清，作为多个临床有用的血清蛋白校准品。制备了5个候选制品，其中之一被选择为人血清蛋白的参考物质。这个物质的一半冻干于疫苗安瓿中（1.5 ml/安瓿），用橡皮塞封口，储存于美国疾病控制中心（CDCP），为美国国家参考制品（US national reference preparation，USNRP）；另一半冻干于玻璃安瓿中（1.3 ml/安瓿），封口。后者成为WHO的六个人血清蛋白的参考制品（WHO reference preparation for six human serum proteins，WHO 6HSP）。对六个蛋白[白蛋白（albumin）、a1-抗胰蛋白酶原（a1-antitrypsin、a1-protease inhibitor）、铜蓝蛋白（ceruloplasmin）、a2-巨球蛋白（a2-macroglobulin）、转铁蛋白（transferrin）、C3c]以国际单位表示，所以，为以上六个蛋白一级参考物质；又以WHO 67/86为准进行放射免疫扩散试验，将免疫球蛋白值转换给该物质，则相应的结果为二级参考物质。

（3）以后，由24个专家实验室对USNRP设定其各个蛋白的质量值。免疫球蛋白可以从IU转换为质量结果，该转换因子与1972年Rowe报告的WHO 67/86的转换因子不同。USNRP因此成为所有内含蛋白以质量表示的一级参考物质（由于技术进步，USNRP替代了WHO 67/86的免疫球蛋白为一级参考物质的地位）。

（4）美国病理学会（CAP）在20世纪80年代制备了新的参考制品：第一批血清蛋白参考制品（the reference preparation for serum proteins Lot 1，RPSP-1）。该血清为重钙化和脱脂的血浆，被许多实验室和厂商作为参考物质，直至用完。CAP又制备了RPSP-2和RPSP-3；每批的定值均与前批参考物质比较协同。多年后，定值与原来自USNRP设定值有偏离。

（5）1990年，CAP标准委员会认识到，在RPPHS可用之前，RPSP-3将会早几个月或几年用完。在免疫化学试剂和仪器厂商的建议下，为了消除设定值未来的变异，CAP决定使用与RPPHS计划相同的一级参考物质和方法进行值的转换。质量浓度按照CDCP的转换因子将国际单位转换，而不是来自WHO标准的国际单位转换因子（如RPPHS）。CAP的RPSP-4自1991年起可用。

六、可比性问题

各个参考物质只包含为数不多的特定蛋白，尚无一个较完整的多种蛋白参考物质。在实际应用中，以往的国际标准不能解决特定蛋白免疫检测结果之间的可比性问题。

七、构思与建立新的蛋白参考物质CRM 470有什么要求？

1988年成立IFCC血浆蛋白标准化组（后成为IFCC科学部的正式委员会），开始了新蛋白参考物质的研制，要形成新的血清蛋白的国际二级参考物质。由IFCC的血浆蛋白委员会管理（IFCC C-PP）、欧共体参考局（BCR）提供资金，并得到血浆蛋白产品公司的资助。该新物质产生、并被BCR确认为证实的参考物质 470（CRM 470）。CAP参与了这个计划，并购买了半数的物质，接受为人血清蛋白参考制品（RPPHS）。BCR和CAP于1993年一起发布该物质，后又被美国食品药品监督管理局（FDA）认可。在研制该参考物质中注意了以下几方面的问题：

（1）最重要的是要求CRM 470在检测系统中的表现应相似于常规测定中血清样品。所以在物质中存在的蛋白，若可能，应与新鲜血清中的具有相似的物理状态，并在储存中没有变化。使用天然凝集的血清（避免使用凝血活酶，可能会引起蛋白降解；避免凝集血浆，可能会产生不稳定混浊，并随时间变化）；冻干前加入蛋白酶抑制剂，确保处理中的防腐等实现上述要求。实现CRM 470光透明是采集空腹过夜的自愿者血液；使血液自然凝集于玻璃容器中；去除目视混浊的、黄疸的、或溶血的血清；使用微颗粒的硅酸盐吸附残余的脂蛋白。这个程序特别有效；但是，它使总体积减少，并降低了如C4和IgM分析物浓度。

（2）不同人种和地区血清蛋白的同种异型差异是近几年来血清蛋白分析管理的重要课题。所以，用于CRM 470的供体基本信息都被记录下来，包括a1-抗胰蛋白酶原和珠蛋白的表型。以备今后参考物质使用重组相似的混合血清。血液中含有IgM类风湿因子和单克隆组分的，可能也会影响免疫化学测定，应予以去除；同时对每个供体的传染病因素予以控制。

（3）理想状况下，一级参考物质的定值应以纯化的和高度特异的蛋白为准。但是，只有少数几个蛋白可用，而新的国际参考物质迫切需要解决报告质量含量结果。委员会于1989年决定对制品的定值，既使用相对于WHO物质的国际单位（IU）、又使用相对于现今具有质量量的单位。IFCC血浆蛋白标准化工作组已经完成了纯化前白蛋白、a1-酸性糖蛋白、转铁蛋白的方法。Copenhagen大学使用这些方案制备了这些蛋白，并使用于CRM 470值的转移。

（4）定值方案：在美国、欧洲、和日本的27个实验室按照严格的方案被验证检验候选制品的适合性，实验室的性能符合要求后，才能参与合作定值。对CRM 470和相应的一级参考物质都作多个稀释，使所有测定均在两个物质相同的测定范围，每个稀释样品作双份检测等。要求整个检测的范围具有线性，并通过0点，以确保参考物质相似的表现（即不存在基体效应的差异）。回归线的斜率用于定值。在定值的过程中，严格要求使用灵敏天平称量校正所有的复溶和稀释，确保检测可靠性。所以，定值中所有复溶和手工稀释均按此程序实施。

（5）新的国际标准CRM 470的制备和定值大致程序如下

（ⅰ）指定由Behling公司（现为Dade-Behring公司）负责制备国际参考品。

（ⅱ）收集来自法国、德国、瑞典、瑞士、英国的364名供血者血液。要求：

① 血液中无类风湿因子或单克隆组分；无黄疸、脂血、溶血；HBsAg、抗HIV、抗HTLV、抗HCV及梅毒血清试验均阴性。② 血清需及时分离冰冻，送Behring公司，经融化、去脂、加防腐剂、加纯化CRP、加缓冲液，混匀除菌滤，最后分装。③ 按照IFCC定值方案，统一使用指定的各特定蛋白纯化标准或具血清参考物质为原始标准。避免各实验室因使用的标准不一致造成定值差异。方案详细规定了定值的操作程序以及统计方法，使27个定值实验室（欧洲、美国、日本）步调一致，在规定期限内完成定值。④ 允许的测定方法为：免疫透射比浊，免疫散射比浊，单向免疫扩散。

八、怎样正确使用CRM 470作正确度传递？

IFCC强调：

（1）为使CRM 470可以使用较长时期，CRM 470只提供给生产厂商，不直接用于一般实验室。

（2）CRM 470是以血清为基质的参考品，它只用于以血清为材料的商品化校准品的校准。

（3）在进行数值传递（即厂商定值）时，实验方案须与CRM 470定值方案一致。包括：两个互相比较的材料作多次稀释的测定；对样品作多批双份测定；用相应的统计方法等。

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