|
核酸分离和纯化的目的是以最佳方式将DNA和/或RNA从所有其他细胞和细胞外成分中分离出来并进行纯化。纯化可以去除所有（细胞外）成分和其他干扰物质。 后者可能来自于基质和用于分离的生化试剂。一般来说，基质成分会产生负面影响（吸附、抑制和水解），而生化试剂会刺激或抑制测定，如PCR，取决于其浓度。创造一个可以提纯DNA和/或RNA的水环境是非常重要的。
一旦细胞的完整性被打破，许多可能干扰PCR结果的因素就会释放到溶液中。尽管粗制的分离物可以作为PCR的样本，但大多采用纯化步骤。这尤其涉及到容易迅速分解的mRNA。 图1 | DNA分离方案的七个例子 每个方案都从原始的核酸样品开始，最后得到或多或少纯化的核酸溶液。不同的程序可以结合起来，并可能导致最终的核酸溶液的纯度提高。
几乎所有取代苯酚-氯仿-异戊醇提取的方法的关键步骤是使用Boom法，通过这种方法，核酸被存在于磁珠或滤膜上的硅酸盐颗粒捕获（图2a, b）。 图2 | Boom法：使用硅酸骨架和硅藻进行DNA的硅酸盐和亲和色谱法 硅酸盐为核酸在过滤器、柱子和磁拍上的固定化提供了一个通用的基质。钠离子和核酸的磷酸盐基团（DNA和RNA）之间将发生离子结合反应，水和混沌盐的存在。现在，污染物可以用离心法洗净。纯化后的核酸可以再次解离。 （a）硅藻的外部骨架的例子。来自骨架的硅酸盐的极其有利的表面-体积比实现了核酸和载体之间的最大相互作用。 （b）对核酸和硅酸盐在混沌盐存在下的相互作用的化学解释。 某些盐类，如LiCl和异硫氰酸胍（GuSCN），在水环境中选择性地使蛋白质变性。DN酶和RN酶也会变性，从而被GuSCN灭活。因此，蛋白质可以从高分子核酸中被去除，而高分子核酸则留在溶液中。离心法也可用于分离相关的馏分，例如去除红细胞和/或白细胞。 为了从植物材料中分离出高质量的DNA，这种DNA需要从高分子蛋白质/结合物（来自细胞壁/木纤维）和淀粉中分离出来。由于这些材料具有与DNA类似的化学和物理特性，因此出现了分离的问题。 新的提取缓冲液中含有更具侵略性的成分（CTAB、N-月桂酰肌氨酸），有助于将DNA选择性地保留在溶液中。大型深冻样品可以用研钵和研杵研磨。如果基于Boom-/Silicate的方法的回收率不足，有专门的方案和方法用于分离核酸。 为了获得高质量的mRNA，基于GuSCN和苯酚-氯仿的方法仍然是脂肪和纤维样品的首选方法[1]。然而，困难的基质，如粪便、血液、尿液和固定和/或嵌入石蜡的材料，都需要在实施前用各种方法测试相应的分子技术和样品运输[1-4]。
RNA的分离和纯化通常与DNA的分离和纯化相类似。在这两个过程中，细胞的裂解和细胞大分子的溶解是必不可少的。RNA可以通过离心、沉淀或在poly（dT）（真核细胞mRNA）上进行亲和层析从DNA中分离出来（图3）。 图3 | 真核生物mRNA的亲和层析法（poly-A捕获法） （1）样品悬浮在裂解缓冲液中；核酸（RNA）将在可溶相中。 （2）生物素标记的oligo（dT）20与裂解液混合；poly-A/RNA与oligo （dT） 探针杂交。 （3）将50升混合液加入微孔板（或反应容器）中涂有链霉素的孔中。生物素将以高亲和力与链霉菌素结合（CSA）。 （4）用缓冲液洗三次，与oligo（dT）探针解离。现在样品已准备好进行PCR。 用DNase处理可完全去除RNA部分的DNA。由于mRNA被迅速降解（通过破碎或被非常稳定的细胞质和其他RNase（如来自上皮细胞）水解），某些预防措施是分离足够的代表性mRNA的先决条件。 rRNA比mRNA更稳定，因为它与蛋白质相关。一旦rRNA游离在溶液中，它就会像mRNA一样，暴露在各种RNases中。这些RNases可以在手上、溶液中、空气中、玻璃器皿上和实验室设备上找到。工作程序（如不含RNases的工作）旨在灭活细胞中的RNases并防止含RNA的材料接触「外部世界」。 因此，所有的溶液和玻璃器皿都经过高压灭菌处理，或买来不含RNases。在工作中，要戴上手套和/或使用RNase抑制剂。有各种化学品可供选择，每一种都有其特定的功能（DEPC、RNasin、RNA later）。含有甲酰胺的介质，如RNA later，可以防止RNA降解，用它可以取得良好的效果，特别是在处理组织时。 在分离RNA时，可以分离ERM RNA或Total RNA。大约需要106个哺乳动物细胞才能分离出1毫克的总RNA。即使是低表达量的mRNA也能得到足够数量的回收。 真核生物mRNA可以通过聚（dA）尾部与磁珠或含有聚（dT）的膜杂交从粗提物中分离出来。洗去所有其他物质后，用不含RNase的水将mRNA部分与oligo（dT）解离（图3）。
Boom在1990年开发了一种方法，利用二氧化硅颗粒手工分离核酸，该颗粒与核酸的磷酸基团形成可逆的盐桥。通过这种方式，可以从基质中捕获核酸（见图2）。 这些二氧化硅颗粒可以被离心分离，并与分离物中的其他成分分开。丢弃上清液后，可以加入洗涤缓冲液来重新悬浮颗粒，然后再次离心。通过一些清洗和离心步骤，硅酸盐/DNA复合物与污染物如蛋白质、脂质和其他（大）分子分离，而不像苯酚-氯仿提取那样使用有毒物质。通过将二氧化硅颗粒与各种载体（例如顺磁珠）耦合，有可能简化和自动完成洗涤步骤，并相对容易地从复杂的溶液中分离出DNA。 在洗涤步骤之后，核酸在小体积的低摩尔的缓冲液（含10mM TrisHCl/0.1mM EDTA pH 8.2）中从二氧化硅颗粒中被洗脱出来。纯化的核酸可以被定性并立即用于进一步的步骤。 如今，Boom方法被纳入了自动化系统。通过这种方式，许多样品可以以标准化和无污染的方式被分离出来，这对诊断实验室来说是至关重要的。 自动化提取设备有许多形状和尺寸，为小量、中等量或非常大量的样品进行了优化，专门处理DNA、总RNA或mRNA。通过确定从加注的模型材料中的回收率，可以确定产量。据报道，各种商业系统在产量、纯度和完整性方面有很大差异。 为了保存核酸分离物，可以将洗脱缓冲液蒸发掉，得到易于在室温下保存的固体亲水粉末。在使用前，通常将该粉末溶解在相同体积的无核酸酶的水中。另一种方法是将洗脱液冷冻，储存在-20℃或-80℃。 参考文献 [1] Chomczynski P, et al. The single-step method ofRNAisolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006;1 （2）:581–5. [2] Hosomi K, et al. Method for preparing DNA from feces in guanidine thiocyanate solution affects. Sci Rep. 2017;7:4339. [3] Gerasimidis, et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Res Notes. 2016;9:365. [4] Psifidi A, et al. Comparison of eleven methods for genomic DNA extraction suitable for large-scale whole-genome genotyping and long-term dna banking using blood samples. PLoS One 2015;10（1）:e0115960. doi:10.1371.
|
