新手须知的qPCR操作技巧

实时荧光定量 PCR（qPCR）自问世以来，就受到了广大生命科学实验工作者和医院检验工作者的极大关注，使得该技术得到了很快的普及。虽然qPCR技术目前应用方向十分广泛，但是仍碰到很多用户在实验中存在着由于不当操作而数据精度不高、重复性差、可信度差等问题。

使用引物设计软件进行设计时，在操作界面上设定相应的参数，扩增子参数一般设定范围为80 ～ 200bp，扩增子长度越短，扩增效率越高，可选择设定在110bp，110bp在后期的扩增中仅用10s，其余的参数均默认，软件即给出引物列表，一般选用评分高或者靠前的，因为评分越高或越靠前的引物对形成引物二聚体的可能越小。

引物一般由试剂公司合成，为干粉状态，在溶解前，最好用高速离心机低温快速离心30s，使得引物干粉汇聚到管底，避免损失引物。引物收到后，需要先摸索引物的退火温度和终浓度，以达到较理想的qPCR扩增效果，其次测定引物的扩增效率，通常在非正式实验时，假定引物的扩增效率为100%，扩增产物在指数期呈现2n的增长。

在正式实验时，考虑到引物的扩增效率实际不是100%，所以需要测定引物的扩增效率以修正结果。一个测定引物扩增效率的简单方法如下: 以cDNA样品或标准品为模板，依次稀释 10*1、10*2、10*3、10*4、10*5、10*6 倍，采用前期摸索好的qPCR扩增条件，得到6个Cq值，然后以log（模板浓度）为X轴变量，以Cq值为Y轴变量作回归直线图，得到直线的斜率，扩增效率 = 10( －1 /斜率) － 1，整个数据计算可以在Excel中完成，也可在qPCR软件中直接得出。

正式实验时，每个样本至少3个重复，为了消除各重复之间的系统误差，将所需的所有试剂和模板加在同一个PCR管中，充分涡旋混匀后，再分装到3个重复孔中，这样可有效减小系统误差。

另外，一些实验者为了节省试剂，采用10μL反应体系，我们认为这是不可取的，因为体积太小，加样误差会大，这样做得不偿失，建议使用20μL以上的反应体积。如上操作，可以在较大程度上消除由于加样不准造成的系统误差。

如表1所列，“优化前”是5管中分别依次加入模板和各反应试剂，最后得到的Cq值标准偏差为2.66；“优化后”是使用模板和各反应试剂的混合液，然后分装至5管中，最后得到的Cq值标准偏差为0. 32；由上述可见，数据精度得到极大的改善。

阴性对照一般是指用水代替模板的反应孔，体系中除了模板，包括了其他的反应组分。由于qPCR的高灵敏性，阴性对照有出现扩增信号的情况，那么在针对这类问题时，我们需要判断其原因所在。

使用染料法进行qPCR实验时，首先查看阴性对照的溶解曲线主峰是否跟阳性孔的主峰位置一致。如果一致，要看两者Cq相差多少，比如，针对某一种引物的实验样品Cq值为28. 5，阴性对照的Cq值为33. 6，由于Cq值相差大于5，如果按95%的扩增效率计算，两者模板量相差28倍之多，对分析数据影响不大，所以实验样品的Cq值还是可以采用的；

但是，如果两者的Cq值仅相差 1~2，这说明阴性对照中有较大的模板污染，则需要考虑更换试剂或引物，分区加样，重新实验。如果不一致，阴性对照主峰对应的Tm值小于阳性孔的Tm值，则可能是引物性能不好，无模板或使用低浓度模板下会出现引物二聚体，这种情况则需要考虑更换引物，保证引物特异性以及扩增效率。

▲ 图1：溶解曲线主峰位置基本一致时，S3是实验样品，NTC是阴性对照，

两者Cq相差大于5，实验样品的Cq值还是可以采用的。

▲ 图2：溶解曲线主峰位置不一致时，STD-1是高浓度样品，STD-5是中浓度样品，

STD-8是低浓度样品，NTC是阴性对照。随着模板浓度降低逐渐出现引物二聚体，
导致扩增效率测得不准确。

使用TaqMan探针法进行qPCR实验时，由于探针法的高特异性，如果阴性对照出现扩增信号，很大可能是模板污染或气溶胶污染导致，操作时注意分区加样，避免污染。

进行相对定量分析时，最常用到的是 2-ΔΔCq法，但是这种方法比较粗放，因为它的前提是假定所有引物的扩增效率都为100%。更为准确的定量则需要考虑不同引物扩增效率的差别。可首先用梯度稀释的模板测试各引物的扩增效率E，获得实际扩增效率之后，后续实验只需要在软件中直接输入扩增效率E值，即可计算更精准的相对定量值。