细菌总数检测

1、菌落(colony)：是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。

2、菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(m1)或表面积(clni )内，、所含能于某种周体培养基上，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。

3、菌落总数的测定是以检样中的细菌细胞和培养基混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。由于待测样品往往不易完全分散，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自2个或多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位（colony-forming unit,CFU）取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。

平板菌落计数法虽然操作比较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果易受多种因素影响，但是，由于该方法能直接反映样品中活细胞数量，所以被广泛应用。下边就比较容易影响总菌数测定的几个因素进行介绍：

1、实验材料的准备

无菌操作的材料都要经过高温高压灭菌；称量勺可过火焰灭菌，称量纸不得重复使用；涂布法要使用的培养基应预培养12小时，去除长出杂菌的平皿。

2、稀释液制备和样品稀释

样品的稀释液一般用生理盐水，但是也可根据检测样品的特性加入保护剂成分，如吐温。样品在进行梯度稀先要用稀释液充分溶解，可以选择摇床或磁力搅拌。摇床转速稍低可以搭配玻璃珠或延长溶解时间，但要注意恒温，以防止样品中微生物增殖。

3、稀释度的选择

对于微生物类产品的检测，应当根据标示量和最终的单个平皿上的菌落数（30-300）以及平板中菌液的添加量来选择适合的稀释度。如100亿的凝结芽孢杆菌产品，平板中菌液添加量为100μ时，只能选择10⁷的稀释液来添加才能使得平皿上的菌落数在30-300的有效区间内。同理，如果确定了稀释液的倍数就要通过平皿中菌落的添加量来调节平皿上最终的菌落数。

4、平板接种和培养

由于细菌易吸附到玻璃器皿表明，所以在稀释液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，以防止细菌增殖及产生片状菌落。可顺时针逆时针交替轻轻晃动平皿（至少20次）。等琼脂凝固后放入培养箱内倒置培养，可避免菌落蔓延生长。如果采用涂布法，在平板中添加的菌液量不应超过200μ，而且菌液要涂干才行，徒步过程中可旋转平皿角度，实现涂布均匀。

5、菌落计数

达规定培养时间，应立即计数，如果不能立即计数，应将平板放置于4℃保存，最好不要超过24小时。如果到规定时间，菌落还太小不方便计数时可适当延长培养时间，但不能超过8小时。进行菌落计数时，应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况：平行试验的 平板上菌落数应该接近，不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越大菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，则可能在实验过程中因操作造成杂菌污染。