【冯仁丰】系列讲座 33 定量检验线性性能的评价和验证

美国临床实验室标准委员会（NCCLS）从1980年起，组织专家起草了四个检测性能的文件。第一个是精密度。第二个就是线性。充分说明美国的临床检验界对检测分析性能中，除了精密度之外的最重要分析性能是检测线性。

自从我进入上海市医学化验所，开始接触定量检验工作。我的前一辈的检验人员带着我学化验，他们让我一定要知道线性的重要性。

线性在手工操作年代，是手工方法赖以决定被检测病人的结果的关键点。将标准液与病人标本一起检测。从标准液的比色吸光度，与病人样品检测比色吸光度比较，乘以标准液的分析物浓度，即可得到病人样品该分析物的浓度结果。但是决定这个计算的前提，一定是确认了实验室对该分析物的检测结果，在吸光度和分析物浓度的某个范围内，具有通过原点的直线关系。可是，在当时检验界很少去想得那么深！只知道完全按照操作规程对病人标本检验就是了。

可是在医化所里，我遇到了好老师。他们带着我做检验，让我知道怎么去绘制标准曲线。因为没有绘制标准曲线的能力，检验人员是做不好检验的！因为绘制标准曲线时，必须首先将储存标准液，做好稀释。至少让各个标准液分析物浓度间的关系符合要求。然后，必须对个标准稀释液进行多次重复检测取均值，与分析物浓度绘制标准曲线。每一个稀释标准液下的所有检测比色吸光度，必须要有非常好的一致性！方能确保绘制的标准曲线是像样的！

我是在这些长辈的引领下，逐渐地会做化验了。而且是真正地学到了做好检验的要领！为我以后开展的各个检验发展，打下了基础。

所有书上写的是绘制标准曲线，不是绘制标准直线！为什么？但是几乎在所有分析物的各个章节中，写的计算结果，几乎无一不是病人样品检测吸光度，除以标准的吸光度，乘以标准液的分析物浓度！能够这样计算结果的操作方法，其实都好像已经认可了，这个方法的比色结果是呈一条通过原点的直线！

以后，我领悟出：期望每个方法的比色结果呈一条直线。但是实践告诉了，也许只有极少数的检测方法，真正的具有像是一条直线！太多的方法是近似一条直线！其实严格地是曲线！所以被说成“绘制标准曲线”！

究竟如何描绘一条检验中的标准曲线？绘制标准曲线应该怎么做？要几个标准液？每个标准液需要重复检测多少次？如何判断这是一条直线？等等，都是我一直在思索的。

看到了EP6-P的文件，我非常高兴。因为它正是我希望的！回国后立即深入学习。

Richard B. Passey博士承担了编写线性文件的任务，这个编写工作组的成员不多，仅4人。他本人在Oklahoma Memorial 医院工作，David E. Bee是Texas大学医学部的博士；还有两位博士来自Dupont Company和Gilford Instruments公司。

Passey博士在给用户的信息中说：线性是对大多临床实验室个人熟悉的概念。但是，在临床实验室文献中，缺乏严格的定义。而且还缺乏为stating说明和评价线性claims for lineariry一致的format格式计划。这个缺乏的定义使得在概念和评价定量临床实验室方法方法线性的方法上都很混淆。

本文件的目的是提供给你，实验室中定量分析方法的用户，一个评价方法，是否仪器或方法符合的厂商的线性规范（specification规格）。我们也已经为厂商提供了说明检测线性声明的指导。线性检测评价将增加你的能力，去判断该分析物分析是否符合临床要求。另外，你可为一个分析方法设定线性限值。

线性委员会assigned被分配的任务是，定义、说明、和评价线性，由统计学家、仪器和试剂厂商、以及这些产品的用户组成。我们欢迎你对我们的努力做出评论，你的评论和你的帮助。

从这些内容可以知道，在近35年前，主持编写线性文件的专家们是怎样起步的。

这个文件形成的评价线性的方案，得到了临床实验室行业的称赞。

我学习了这个文件，懂得了如何进行线性实验的要求，使用直线回归统计得到最佳的线性配合，而且从直线回归线标准误，估计处组成回归线的所有点不具有线性的严重问题！

我在实验中去领会EP6文件的含义。非常有帮助。

当然，在EP06-P出现后的许多年里，逐渐被大家发现，这个线性评价方案的不足。

2003年，另一组专家全部修改了EP6文件。被批准为EP6-A。

这个文件的主席是Danial W. Tholen。是统计学者。

该文件有一段话说明更新的内容和理由。

在EP6批准版内列出的方式，代表了与以往版本上统计方式上的显著改变。

第一版（EP6-P）使用了统计“失拟 Lack of Fit”检验（LoF），作为确定线性的纯粹基础。这个方案，使用5个等同间隔的浓度进行分析，每个水平进行4次重复。对这些点以回归直线拟合，产生了两个方差估计-- 重复检测间的混合方差，和五个均值环绕回归线的方差。这些方差的比率是LoF检验的基础。这个方式的一个问题是非常精密得系统具有很小重复检测检的方差、和在比率LoF检验中，均值的非常小的偏离被看来在统计上是显著的 - 或非线性。也有可能- 尽管频率很少 -- 重复检测间极端大的方差，可造成无法检出临床上重要的非线性。

这个多项式方法（EP6-A）在概念上非常类似原先的LoF检验。在二者程序上，有两个另外的统计模式（线性和非线性）；它们相对于哪一个看来是最像的进行评估。但是，多项式方式，为非线性alternative的替代，有一个特定的参数模式，为了较好地证实特定非线性的条件，单纯重复性精密度被包括在in a positive way正面方式。较好的精密度导致较好的决定，很差的精密度在做出线性决定前就被过筛去除。这个方式统计方式：

· 估计每个水平的非线性大小；

· 在评估非线性上开展不可接受的重复性；

· 提供一个表格式的统计模式；

· 以广泛可用的软件容易操作。

前一个版本中另一个关键概念被保留，即必须先做图作为线性评价的第一步。目视检查将协助用户决定哪个统计评估可以为确定是否有显著的非线性，以及相对于预先确定的目标非线性的大小。

如果仅仅认为，这个EP6-A是CLSI到时邀请有关专家修改或改写这个线性的文件，我们的认识错了！

不要忘记，美国政府为了强化对美国临床实验室的质量管理，在美国政府的参议院和众议员共同参与下，1998年批准了美国临床实验室修正法规（CLIA'88）。CLIA'88法规已经成为今天美国临床实验室对病人标本检测发出报告必须遵循的！在这个法规文件中，对临床实验室开展检验，使用的检测系统必须具备的分析性能做了非常具体的规定，包括线性要求。美国的临床病理协会（CAP）紧密配合CLIA'88中，对校准和校准验证的要求，从1992年以后组织安排了校准和校准验证、与线性的调查计划（CVL计划）。为了让整个美国的临床实验室都理解和知道，什么是校准和校准验证？什么是线性？CAP在Dr.Kroll领导下，普及和教育美国临床实验室。而这些内容的主要内容，正是现在成为EP6-A文件的前身！有了这样的基础，才出现了EP6-A文件！今天，几乎所有的美国临床实验室无人不知，什么是CAP的CVL计划？什么是EP6-A？

因此，我们在学习这些文件时，还必须与美国对实验室管理开展的这些活动结合起来。

当然，2020年美国的CLSI（临床和实验室标准研究所），推出了EP6-A2文件（EP6-Ed2），并且决定与这个文件替代了原EP6-A文件。可是，面对整个美国临床实验室，都接受CAP的CVL计划！进行这项工作的基础就是EP6-A文件！无形中，使得这个EP6-Ed2变得没有了地位！事实上这个新版本的文件，也因为过于追求完美、跟踪ISO，因此这个文件也许已经没有什么实验室可以按照这个文件，开展线性的评价、或建立实验室某个分析物的线性了！这是事实！

EP6-Ed2文件发表于2020年。编写主席是：Robert J. McEnroe。没有说明他的来历。还有一位参与编写的人是A. Paul Durham。我已经注意到，凡是这些CLSI的分析性能文件中，出现了这位Durham的，一定会有非常认真和详尽的统计方案！倒是让临床实验室已经无法应用这些文件方案，在实验室中实施。

为了让大家对线性方案的各个版本，都有一些了解。我将尽力为每个文件中的关键要点做一些我理解的介绍。相信大家从中会得到一些需要的内容。