【冯仁丰】蛋白质标准化：免疫散射比浊和/或免疫透射比浊检测方法的最佳化 3 ...

读数原理

现代自动仪器按照关于试剂的混匀和信号的阅读的三个不同原理之一操作。其中两个原理展现在以下离心分析仪上，于340nm得到免疫透射比浊的结果。

a）真实样品空白

理想方式得到最适信号展现在图6和图7.

  首先，加入反应缓冲液到反应比色杯。然后，加入样品，与缓冲液混合，在预温阶段最后，读取第一个读数。这是真实的样品空白（图6和图7中标记为“1st reading”），被储存在仪器记忆中。

图7、作为时间函数形成的信号。使用人IgG作为“真实样品空白”示例。

下一步，加入专一的抗体，与被预温样品混合。因抗原与抗体间的反应，在很短的时间里形成了浊度。

在信号变得接近恒定，说明反应已经接近终点 — 通常在4-6分钟后 — 读取第二个读数（在图6和图7中标记为“2nd reading”），储存在仪器的记忆中。这个读数是代表样品空白、试剂空白、和抗原-抗体反应的信号之和。

在相同时间间隔，试剂空白在单独的比色杯中以相同的时间间隔平行检测。终点信号代表了，在反应缓冲液和空白样品（如水或盐水）和抗体本身混合引起的浊度。这个值，仅在一个比色杯中获取，被用于纠正来自样品比色杯所有信号。理想地，试剂空白值应非常低。

用于计算的信号可参见表1。

样品比色杯和试剂比色杯的值之差，从第二个读数中减去各个第一个读数（最后一栏）。

在减去试剂空白读数后得到了最后信号。在抗体过剩区带得到了提供的样品读数，最后结果随样品中抗原浓度升高而升高。

在抗体加入前即刻阅读的读数的原理，经常被提及为：真实样品空白或使用样品预温的两个试剂原理。

这个原理展现在图6和图7的两个不同血清蛋白质，IgA和IgG。

b）混合所有试剂后即刻的空白读数

一些自动仪器按照另一个原理操作，混合试剂和阅读信号，如图8和图9所示。

图8、作为时间函数形成的信号。“混合所有试剂后即刻的空白读数”，使用人血清IgA为示例。Ag：抗原，Ab：抗体。   

图9、作为时间函数形成的信号。“混合所有试剂后即刻的空白读数”，使用人血清IgG为示例。Ag：抗原，Ab：抗体。

开始，反应缓冲液、样品、和抗体混合。然后，尽快，通常混合后的5-10秒，取第一个读数，并储存在仪器的记忆中，作为空白值。

4-6分钟后，反应已经达到它的终点，取第二个读数，并储存在仪器记忆中。该信号用于如表2所示的计算中。

最后得到的结果简单地从第二个读数中减去第一个读数。

这个原理的优点是，当然，它节约了时间，因为没有了预温，它有些简单。由于没有要求检测试剂空白，经常被作为简单的试剂系统。

但是，这个原理有很严重的缺点。

首先，5-10秒对所有样品稳定和达到一个恒定的信号不总是足够的。这会要求到2分钟。所以，第一个读数会不包括总的样品空白，但仅仅是一部分。

第二，免疫反应已经开始，早期的反应信号被丢失。作为一个“缓慢”的反应系统，如IgA，在与抗体混合后的第一个读数在5秒钟，不是非常严格的（图8）。

但是，作为“快速”反应系统，如IgG，已经反应了一半才取第一个读数（图9）。事实上，许多蛋白质与相应抗体的反应非常快，延误5秒钟变得很关键。在抗原和抗体间的反应是这个时间运行处于最大的速度，所以，很难确定得到第一个读数的点。

“混匀所有试剂后的即刻空白”的实际含义，可容易地通过比较由IgA和IgG的6个标准的信号形成曲线上予以展现（分别为图10和图11）。

图10、以人IgA为例，6个标准以时间为函数的信号发展。Std，标准；R，试剂。

图11、以人IgG为例，6个标准以时间为函数的信号发展。Std，标准；R，试剂。

对于缓慢反应的IgA系统，5-秒钟的延缓不显著。

对于快速反应的IgG系统，在第一个5秒钟期间，有相当多的信号发展。这使得（第一个读数的）秒时间和第一个吸光度读数间有显著差异，看来丢失的信号随标准中IgG浓度增加而增加。

IgA的标准曲线实际上没有被两个空白方式间的差异所影响（图12），但在IgG的标准曲线绘制中有着很大的影响（图13）。这里丢失的信号对较高标准越来越明显，造成要低得多的“较低”的标准曲线。

在图14中，为离心分析仪上第一次读数的时间对标准曲线数据的影响。在离心分析仪达到了它最后速度后的0.5秒时，取第一个读数。由于这个仪器要求4.5秒钟达到完全的速度，图中括号内是抗原和抗体混合后过去的实际时间。

图15为两个不同的空白原理得到的、在IgG标准曲线上的插入。“较低”和“平坦”的曲线，是“混合所有试剂后即刻的空白”得到的，造成分析不精密度有明显增加，因为读数是在反应曲线的陡峭部分进行的，此处在动态和读数时间下的很小变异，会影响检测的不精密度。由于反应是在最大速度下运行的，特别重要的是，所有样品和标准必须确实是在相同时间下读数！

图12、以“真实样品空白”和“所有试剂混合后的即刻空白”得到的IgA标准曲线。 

图13、以“真实样品空白”和“所有试剂混合后的即刻空白”得到的IgG标准曲线。

图15、IgG标准曲线。以“真实样品空白”和“混合所有试剂后即刻空白”得到的两个标准曲线上插入的影响。

而且，很重要的要强调，如果病人样品中实际蛋白质的反应速度，与校准品中该蛋白质的不一样，出现了更不准确，当然这个情况看来不像发生。

在展现不同编程原理对两个的标准的影响，IgA和IgG被选定为缓慢和快速反应蛋白质的示例。在一个仪器上（Cobas Mira Plus）进行测定，相同样品和相同试剂；仅仅是仪器编程不同。

图16显示了两个读数原理对IgA检测结果的比较。因为这是一个缓慢反应蛋白质，信号的丢失不是关键，相关是可接受的。

这些实验明确地说明在测定蛋白质时，正确编程的重要性。

图16、依据“混匀所有试剂后的即刻空白”（ordinate纵坐标）和“真实样品空白（横坐标）”测定IgA。是缓慢反应的示例。

图17、依据“混匀所有试剂后的即刻空白”（纵坐标）和“真实样品空白（横坐标） 测定IgG。是快速反应蛋白质的示例。

具有相同的仪器和使用相同的试剂的两个实验室，如果仪器编程不相同，将从来不会得到相同病人的结果。对快速反应的蛋白质反应，这变得更显著。IgG就是一个例子，但白蛋白和C-反应蛋白（CRP）是快速反应蛋白质的其他例子。

对抵消信号的丧失，你可试着增加抗原和抗体二者的浓度。但是，这样做有局限性，至少对离心分析仪。增加浓度导致较快和较高的信号的发展，但也形成了较大的免疫复合物，在离心分析仪（100×g）中趋向移动，由此影响了终点信号。这个现象在普通的分光光度计上（1×g）的平行实验，在整个相同的时间阶段没有观察到。

c）反应速度为时间的函数（动态的或速率检测）

第三个原理是随着反应进行计算反应速度 -- 换言之，计算每单位时间信号的增加，然后使用计算的最大值，速率（max），作为信号（见图4）。为了精确地做这个，读数必须非常扣住时间间隔，如，0.1-0.2秒，在整个检测时间里，样品反应杯必须恒定地置于光路下。只有非常少的仪器，不可被用户完整地编程（被称为“封闭”或“black box”仪器）使用这个原理。

通过使用这个纯动力学原理与真实样品空白，假设在病人样品中实际蛋白质与校准品中的蛋白质以相同速度反应。但是，这经常不是这样。

总结

在所有类型仪器中，应很容易得到一个显著信号。出现的问题，仅在反应已经开始后何时读取第一个读数，以及要求很宽的、非常实际的检测范围。仪器具有在加入样品后、但在抗体被混合前，读取第一个读数的特征；因此对蛋白质测定是合适的，由于空白和免疫化学反应可以分开优化。

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