蛋白质标准化：免疫散射比浊和/或免疫透射比浊检测方法的最佳化 2 ...

冯仁丰

自动化仪器

今天，市场上有多个类型的自动化仪器。一般可分为两个类型：离心分析仪和静态仪器（非离心分析仪）。

b）静态仪器（非-离心分析仪）

这些仪器中比色杯大多安排呈一个圆圈（转子），它缓慢地按照固定时间区间旋转（周转时间）。只能在样品或试剂应用和阅读的区间时，才能进入比色杯。大多情况下使用了机械搅拌设施进行混匀。现代仪器看来越来越多地依据这些原则。

静态分析仪的示例依据透射比浊的包括：Cobas Mira和Mira Plus（ABX Diagnostics，Montpellier，France）、Cobas Integra家属，Hitachi 700-系列和900-系列（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany），Technicon RAXTTM/AXON （Bayer Diagnostics，Munich，Germany），Olympus家属（Olympus Diagnostics GmbH,Hamburg,Germany），Abbott Aeroset（Abbott Laboratories,Chicago,IL,USA），Bayer Advira（Bayer Diagnostics），KoneLab（Thermo Clinical Labsystems,Espoo,Finland），Eppendorf ELAN（Eppendorf, Hamburg, Germany），和Beckman Synchron（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）。

  透射比浊的检测单位是依据正常的分光光度法，使得这些仪器为快速检测和自动的分光光度计。作为一个方式，荧光的一个光学单位，可用于散射比浊检测。只有很少的专业仪器，Dade Behring Nephelometer家属（Dade Behring, Marburg, Germany）和Beckman Coulter ArrayTM（Beckman Coulter）使用了光检测单位，纯粹依据散射比浊仪（或是终点或是动态检测）。

c）软件控制

所有仪器的操作在软件控制下。这个软件的一部分是用户界面，它可以对仪器编程，进行分析和按照某个最佳方式进行计算。分析参数可用为用户控制的在仪器间各异。但是，分析编程（样品体积、预温、加抗体、读数区间、曲线拟合、和计算），为得到最佳和可靠结果是极其重要的。

  有些仪器，但是，为“封闭仪器”，即所有参数设定在仪器上，使用打孔卡或条码识别的试剂/磁带。在这个情况下，用户不可控制检测，但必须完全依赖厂商。

基础说明

在透射比浊和散射比浊中各个抗原-抗体反应的特性，必须要研究下列函数，其中信号是光散射或吸光度：

a）信号的形成是时间的函数；

b）反应速率是时间的函数（动态的或速率检测）；

c）信号形成是抗原浓度的函数；

- 剂量响应曲线；

- 标准曲线

以下，对这样的检测一般特征进行展现和叙述。

a）作为时间函数的信号的发展

抗原和抗体间反应需要一段时间达到终点。图3展现了信号作为时间的函数的发展。

1、反应的第一步，加入缓冲液到比色杯。由于比色杯里没有发生反应，信号依然恒定。

2、第二步，加入含有抗原的样品。由于含有蛋白质的溶液将引导光的散射和吸收光，造成信号增加。样品信号在较高水平处稳定一个阶段的时间，依赖于蛋白质的浓度，和特别在样品内脂蛋白的水平。这第二步检测被视为“样品预温阶段”或“样品空白步骤”。

图4、反应速度（速率），为时间的函数。箭头说明加入缓冲液、抗原（Ag）、和抗体（Ab）到反应比色杯内

3、第三步，加入专一的抗体溶液。免疫化学反应即刻开始，在一个阶段时间里发展，通常在4-6分钟后，达到某个终点。但是，一些抗原/抗体系统需要更多的时间使反应完成。

通过从终点信号中减去在添加抗体之前获得的样品信号（样品空白），得到了代表免疫反应的一个信号，可用于计算抗原浓度。随意任选地，可以对抗体溶液本身（试剂空白）的信号进行校正。

b）作为时间函数的反应速度（动态的或速率检测）

免疫化学反应的速度（形成不溶性免疫复合物）随着反应的进行变化很大。这个反应速度、或是速率，可以概述为每单位时间的变化（图4）。数学上，这个曲线代表了图3的微分形式，各个步骤实际上是相同的。

加入样品后，反应速度从最大后它稳定趋向零。在加入抗体并与抗原混合，观察到的是相同的。在开始处，反应速度快速增加，然后它达到最大，最后缓慢地下降趋向零（终点）。最大反应速度，速率（max），是 — 处于恒定的抗体浓度— 是加入抗原量的函数。为准确地计算这个速率（max），必须频繁阅读结果，每0.1到0.2 秒阅读一次；在整个检测时间里，样品必须恒定地置于光路下。

c）作为抗原浓度函数形成的信号

剂量-响应曲线

通过绘制在恒定抗体浓度下，随抗原浓度增加得到的信号关系，得到剂量-响应曲线。为了得到完整的剂量-响应曲线，必须使曲线达到最大，并开始减少直至趋向于零。这与Heidelberger和Kendall曲线在图1中叙述的是类似的；尽管剂量-响应曲线是在透射比浊下得到的，需要有多得多的稀释系统。剂量-响应曲线合适部分在平衡区的左侧 — 即在抗体过剩区 — 被选择和用作标准曲线。

标准曲线

标准曲线是剂量-响应曲线的一部分，被选定覆盖了各个蛋白质关联的检测范围。标准曲线可从校准检测批获取，记录来自校准品不同稀释液得到的信号，与已知检测蛋白质的浓度。

图5显示了用于免疫透射比浊的最适标准曲线。