一文读懂HBV RNA检测

中国是乙肝大国，也是肝癌的重灾区，每年新增肝癌患者高达47万，其中80%为乙肝相关肝癌。乙肝抗病毒之路虽然艰难又坎坷，但在此漫漫长路中，随着抗病毒适应症的扩大、新的血清学指标出现，距离世卫组织WHO提出的2030年消灭乙肝的目标又更近了一步。

在近年来乙肝新型血清标志物中，HBV RNA是备受关注的一个。经过二十余年的研究与沉淀，其产生路径和存在形式的神秘面纱已被揭开，临床意义也已明朗，针对于它的定量检测，目前市场上已有成熟稳定的技术，随着商品化试剂的普及，HBV RNA已进入临床诊疗的应用阶段。全球第一个商品化的HBV RNA检测试剂盒（SAT，RNA捕获探针法）上市已经一年有余，如今RT-PCR（PCR-荧光探针法）检测试剂也已上市，我们在此将从检测灵敏度、搭载设备等方面对两种不同的方法学进行客观的剖析与比较。

在与新冠病毒抗击的过程中，我们充分体会到了检测试剂灵敏度的重要性。检测灵敏度不够，就可能导致阳性感染者的漏检，随之而来的是一座城的瘫痪，一段时光的消音与静止。

在乙肝治疗过程中，检测结果作为临床医生的另一双眼睛，检测灵敏度及结果准确性对疾病诊疗的重要性不言而喻。HBV RNA一个重要的临床应用场景是作为“准临床治愈”指标，评估患者停药后复发风险。如果其检测灵敏度不够造成漏检，可能让一个本不该停药的患者停药。

APASL指南：慢性乙肝患者停用核苷（酸）类似物指出，“NAs停药后产生病毒学复发的患者，发生肝纤维化、肝癌等不良后果的风险大大增加^[1]。”

一项入组10192例的研究显示，停药后重启治疗患者4968例，其中重度肝炎459人（ALT大于5倍），死亡43人^[2]。千里之堤，溃于蚁穴。多年的抗病毒治疗功亏一篑，造成患者病情复发，身心饱受折磨，医患关系也会更为紧张。

检测试剂的灵敏度对于乙肝诊疗的影响我们可以从HBV DNA发展史中窥见。

• 普敏DNA vs.高敏DNA

众所周知，乙肝DNA检测对病情的诊断、治疗起着指导性作用，尤其在发现它与肝癌发生密切相关之后，更是将DNA转阴作为乙肝治疗的首要目标。而随着对乙肝疾病认识的深入，临床医生出于疾病诊疗的需要对乙肝DNA的灵敏度提出了越来越高的要求。

据研究显示，使用检测下限为12IU/mL的试剂进行检测，DNA定量在12IU/mL-2000IU/mL（低病毒血症）患者中，有25%的患者发展成为肝癌，而DNA检测阴性的患者肝癌发生率为10%^[3]，因此，使用更高灵敏度的试剂进行检测，是否能有更多的普敏“阴性”患者被发现并积极进行治疗，以此减少肝硬化、肝癌等不良结局的发生。20IU/mL、10IU/mL的高敏DNA检测试剂应运而生。

• 普敏RNA vs.高敏RNA

而灵敏度对HBV RNA检测的重要性比DNA更甚。

HBV RNA主要应用于经治后的慢乙肝患者，此类患者HBV RNA载量普遍较低，对检测试剂灵敏度提出了更高的要求。尤其在指导停药方面，普通灵敏度的检测试剂会漏检RNA阳性患者，进而误导医生判断，导致疾病复发。参考上文的大样本研究数据计算，如果1000个患者用普敏RNA检测停药，漏检率为10-20%^[4-5]，则有100-200个患者漏检，将有10-20个患者引发重度肝炎。

因此，高灵敏的HBV RNA检测试剂对疾病指导至关重要。

那么到底影响灵敏度的因素有哪些？

• 方法学

HBV RNA的检测与新冠这种RNA病毒不同，乙肝患者的血清样本中既含有DNA又有RNA，其检测的关键点在于如何在不损耗RNA的前提下排除样本中的DNA干扰。

不同的检测方法在这方面各显神通。

RT-PCR方法采用的是DNA酶处理法，提取DNA+RNA两种核酸的混合物，再用DNA酶对DNA进行降解，余下的RNA进行扩增定量。该方法的技术关键点在于DNA酶处理时间，处理时间过短，则残留的DNA会被当成RNA参与扩增定量，处理时间稍长则会导致样本中RNA降解，定量结果不准确。这个“先天性的缺陷”在检测下限上就有所体现，当前RT-PCR（PCR-荧光探针法）商品化试剂检测下限为300copies/mL，定量范围为10³-10⁸copies/mL（外标定量）。

SAT（RNA捕获探针法）检测试剂作为全球第一个获批上市的HBV RNA检测试剂，采用专利的特异性靶标捕获磁珠提取技术解决DNA+RNA混合样本的问题，只特异性提取和扩增样本中的HBV RNA，不受HBV DNA的干扰，因此无需DNA酶处理。SAT（RNA捕获探针法）试剂检测下限为50copies/mL，定量范围为10²-10⁸copies/mL（内标定量）。

由此可见，方法学差异对检测灵敏度的影响，在当前商品化试剂中，SAT（RNA捕获探针法）灵敏度更高。

图1 SAT与RT-PCR方法学灵敏度比较

不同方法学的HBV RNA试剂灵敏度在实验数据上也得到了验证。上海华山医院张文宏教授的一项研究收集170例CHB病人血清标本，评估SAT和RT-qPCR检测HBV RNA的性能，结果发现，在HBV DNA<100 IU/mL血清样本中，SAT的HBV RNA检出率为77.27%，而RT-qPCR为59.09%（图1左）[4]。上海公卫中心陈良教授团队收集了212例CHB病人的血清标本，在HBV DNA<100 IU/mL的血清样本中，SAT的HBV RNA阳性检出率为98.68%，而RT-qPCR检出率为88.16%。（图1右）^[5]

由此可见，无论是方法学原理，试剂盒性能参数，还是实验对比数据，都表明SAT（RNA捕获探针法）比RT-PCR灵敏度更高。高灵敏的SAT（RNA捕获探针法）HBV RNA检测试剂能给临床医生提供更为精准的检测结果。

• 检测平台

新冠疫情对检验科的工作带来了巨大的考验，如何快速出报告？如何在人手有限的情况下完成繁重的检测工作？全自动的分子检测平台必将成为发展的趋势。

RT-PCR的优势在于可使用开放式检测平台，无需专用仪器设备，弊端就在于与传统分子项目一样，需要人工操作，并且比普通的分子项目多了DNA酶处理环节，人工处理更为繁琐。RT-PCR（PCR-荧光探针法）一共需要5个操作步骤，包括核酸提取、DNA酶处理、将处理后的核酸转移至扩增管（需提前人工配制反应试剂）进行扩增、人工判读结果和后续的结果录入，整个流程需2.6-3.3小时。更多的手工操作，会引起实验的可重复性降低，最终影响定量检测结果的准确性。

SAT（RNA捕获探针法）可搭载全自动核酸检测平台（AutoSAT），采血管原管上机，样本进、结果出，全程无人工步骤。且该平台打破了传统核酸批量检测的模式，样本随到随检，整个检测流程共90分钟。全自动检测平台不仅解放了检验科人手，排除人工操作误差，检测结果的稳定性更好，且样本检测的灵活性高、出报告速度快，门诊患者当天就能拿到检测结果，非常适合乙肝诊疗的需求。

生化、免疫、微生物检测等都已进入自动化流水线的时代，分子检测平台的全自动化也将成必然。

HBV RNA作为乙肝诊疗领域的新指标，对疾病诊疗具有传统指标所无法替代的价值。临床医生对于HBV RNA检测的主要诉求主要在检测结果及出报告时间上，灵敏度高、稳定的结果可以更精准地给疾病判断提供依据，快速出报告则给门诊患者提供便利，大大提升诊疗效率。

检验人员对于HBV RNA检测的主要诉求，除了试剂性能，还要求其操作简单、节约人手，能在繁重的新冠检测压力下兼顾该项目开展，可搭载全自动核酸检测平台的产品是最佳选择。

参考文献

[1]Kao JH, Jeng WJ, Ning Q et al. APASL guidance on stoppingnucleos(t)ide analogues in chronic hepatitis B patients .HepatologyInternational. 2021 Aug, 15(4):833-851. doi:10.1007/s12072-021-10223-5. Epub 2021 Jul 23.

[2]Hsu YC, Lin YH, Lee TY, et al. Severe hepatitis flare and relatedmortality after discontinuation of oral antiviral treatment inpatients with chronic hepatitis B: a population-based study. AASLD2021. Oral abstracts 23.

[3]KimJH, Sinn DH, Kang W et al. Low-level viremia and the increased riskof hepatocellular carcinoma in patients receiving entecavirtreatment. Hepatology. ug;66(2):335-343. doi: 10.1002/hep.28916.

[4]张缈曲,张琪然,张寒悦,喻一奇,仇超,张文宏.一种新型乙型肝炎病毒RNA定量检测方法的临床检测性能评估[J].中华传染病杂志,2020,38(12):782-785.

[5]黄晨璐,许伟,胡乾坤,张小楠,李强,黄玉仙,陈良.实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价[J].微生物与感染,2020,15(03):158-165.