【冯仁丰】免疫散射比浊法和免疫透射比浊法 3

冯仁丰

三、免疫比浊方法考虑的问题

1、免疫沉淀方法的历史里程碑

• 1915年  Klett 和 Bloor 采用散射比浊检测血液和牛奶中的脂肪颗粒。

• 1935年   M.Heidelberger 和 F.E.Kendall报告了沉淀反应的定量研究。

• 1938年  R.L.Libby 以散射的方式研究了免疫沉淀。

• 1959年  H.E.Schultze 和 G.Schwick 使用透射比浊对9个血浆蛋白进行了定量检测。

• 1976年  Hyland 和 Behring两个公司推出了散射比浊仪。

2、反应信号与时间的关系

   我借用Mezhmann提供的资料，来说明关系。（图10）

图10、典型的反应信号与时间的关系

由图说明了，在发生免疫反应前，将样品和试剂1加入样品杯，即刻被搅拌。大多试剂1为缓冲液，目的是将样品充分稀释混匀。然后加入试剂2，加入相应抗体，在搅拌下开始了抗原抗体结合产生复合物。产生的免疫散射或免疫透射的检测信号。随着反应时间的延长，检测信号上升。如图所示。

如何处理反应产生的信号？Beckman的ARRAY采用了完整动态处理的速率散射法。如图11。

图11、Beckman ARRAY说明书上图示。为速率散射法。

Dati和Metzmann原先服务于Behringer公司。应该讲，他们参与了整个BN II散射比浊分析仪的开发。在研究免疫散射比浊分析中，很早就注意到免疫透射比浊的可行性。但是，Behringer公司从经济利益着想，将透射比浊放在一边。完整地开发了系列特定蛋白检测试剂、校准品、和仪器。为公司得到了巨大丰厚的经济利益。

在BN II产品说明书内，对免疫散射比浊，介绍了不同情况下蛋白质检测方法学。

说明书说，可以在下列情况下检测抗原抗体复合物产生的散射光：

• 反应完成 = 终点检测（终点法）模式；

• 预定时间间隔下的信号差异 = 定时速率检测模式；

• 反应过程的持续检测 = 全程检测（VLinIntegral）模式。

第一个检测模式为终点检测。仅用于某些选定项目，例如以TCA（三氯乙酸）沉淀法检测血清、血浆、尿液和脑脊液内的总蛋白。

该方法学检测抗原抗体反应的最大浊度。然后将检测信号值与校正曲线比较转换为蛋白浓度。

图12、散射免疫散射比浊的终点检测模式

第二个检测模式为定时速率。这个模式，是在两个时间点检测信号间差异，去确定样品内蛋白浓度。

将反应组分转入比色杯后，第一次检测（起始）在约7.5s（t1）。

第二次检测的t2，可在孵育反应6分钟、12分钟或更长时间（依据设定程序）。

计算t2和t1检测得到的散射光强度差，从校准曲线上得到蛋白浓度或其他单位值（g/L、IU/ml）。

 图13、定时速率检测

这个方法的优点，是在开始时还没有形成抗原抗体复合物时，通过信号差，扣除了反应组分内因基质散射的干扰。

第三个为全程持续监视（VLinIntegral）检测模式。

VlinIntegral是一个新的数学计算处理，用来评估动力学的凝集反应，例如颗粒增强的免疫分析法或沉淀实验。

这个计算的优点是：

• 增加灵敏度；

• 扩大检测范围；

• 确保抗原过剩下的可靠性；

• 缩短检测时间。

由于是全程散射光变化的监视，可以进行每一段时间内的读数变化计算。按照速率变化，确定建立整个动态变化需要的检测窗口的点数。

图14、VlinIntegral曲线

Logit-log曲线

对散射比浊结果的数学处理，很多应用了Logit-Log曲线。将标准品浓度（x）与对应散射光强度（y）各自取自然对数（In），绘制在In x和In y图上。由图上可看到随着分析物浓度的上升，检测散射光强度的变化。如图7-24。该图也称为Logit-Log函数。

图15、Logit-Log函数图

该图表示了检测散射光强度y，与各个校准品浓度C的关系。因为采用了互相取对数表示，反映了免疫反应连续的信号级数变化。

如果logit-log曲线很好，可进行以下计算：

式中：y为检测信号bit值；C为浓度值；y₀为最小计算信号；y_max为最大计算信号；a为斜率；b为截距。

y₀、y_max、a和b均由电脑计算出来的参数。参考曲线的趋向可由这四个参数描述。

使用Logit-Log函数，可以可靠、快速、简便地计算出被检测蛋白质浓度。所以，这个计算方法优于其他评估方法。

如果将

图16、Logit-log函数图

通过逐步统计优化调整曲线，使统计值更好地接近检测值，达到最佳状态下，确定a和b，最后确定四个参数。

为了确定参考曲线的有效性，检测系统根据每一个参考曲线点的赋值浓度，计算出数学拟合曲线的百分偏移。如果这个百分偏移的均值，大于该分析物规定的最大偏离值（如5%），则这条估计的参考曲线为无效。需要重新检测估计。

TO BE CONTINUED