【冯仁丰】免疫散射比浊法和免疫透射比浊法 2

二、散射和透射的关系

历史上，1938年开始出现了 “光反射仪（photon reflectometer）”和以后的“散射仪”。它们在某个固定角度检测散射光强度，即检测液体的“浊度”。以后为临床实验室设计专用仪器，去检测常规程序需要的免疫沉淀结果。至今，还有两个公司的免疫散射比浊专用分析仪。一个是现在的美国DADE BEHRING MARBURG公司，该公司购买了德国的原Behringer公司所有产权，包括了著名的BN°II系统散射分析仪。BN°II分析仪为固定时间模式，但在固定时间下采用了多个检测模式，在约角度10°进行检测。另一个是美国Beckman公司。ARRAY散射比浊分析仪，强调采用速率检测，被称为“速率散射仪”，在角度约60°进行检测；这两个产品依然在使用。

散射比浊信号不能被表达为分子或摩尔消光系数，它们以毫伏（millivolt）或bit为仪器读数。自1954年起，免疫沉淀的散射光强度也间接地以透过光强度的减少进行检测。这个原理被称为“透射比浊法[turbidimetry]”。透射比浊或散射比浊检测设计中，它们的光检测器位置与入射光的光路中不同，可见图6。

图6、散射比浊和透射比浊仪器不同光检测器位置示意图。

在透射比浊检测中，检测了未散射的光量和直接向前光散射的总量。因散射使光在180°方的上的损失，造成犹如 “虚拟”的光吸收表现。所以，透射比浊信号被检测的是吸光度。

光度计的设计要求极度注意平行光，但是对光检测器和透镜的距离和位置不必很严密。可是在散射分析仪中，因散射光的射向四方，厂商在仪器设计和制造中，非常重视光检测器的位置、与入射光的角度，必须确保检测散射光结果的再现性。透射比浊检测在原理上与任何光度计一样，必须保持入射光和射出光始终呈一条直线，保持180°角度。

所以，在不同品牌的光度计间，吸光度检测结果是可比较的，但透射比浊读数在不同光度计间有显著变异（图7）。进行比色检测下，光检测器和比色杯间的距离不会对吸光度检测有影响，但在散射比浊上，光检测器与比色杯位置不同的仪器间，被检测的散射光表现的吸光度值的比浊读数有很大差异。

图7、光检测器位置对透射比浊信号的影响。

另外，由于进行散射比浊出现的光散射值，检测的是发生散射的光强度。而使用透射比浊的读数，是被免疫颗粒散射后余下的射出光与未经散射前入射光的比值。吸光度读数很大，实际上是被散射后余下射出光的强度很小。因此，在散射比浊仪上检测的散射光强度越高，得到的散射光读数更大。为了让散射仪器可以检出合适的散射光强度，散射比浊必须将检测样品进行很大的倍数稀释后再行检测。而这样的稀释，会需要进行多次。使得最后反应后检测读数的精密度受到很大的影响。散射比浊检测的灵敏度很高，但是检测的重复性有问题！有文章报告（图8），对样品中IgG检测，使用了散射比浊和透射比浊。得到的IgG的均值大致相同；但检测的不精密度还是散射要差得多。

图8、透射比浊和散射比浊的蛋白检测精密度

出现散射比浊结果精密度要差于透射比浊结果的原因，还是散射比浊检出的是被免疫复合物散射出来的光强。样品中某个蛋白质含量较高下，它与试剂中聚苯乙烯上的对应抗体反应产生的凝聚颗粒越多。在此情况下，要使散射比浊检测的光强在一定的范围内，必须对检测样品进行更大倍数的稀释。在BN°II的免疫散射比浊仪上，专门具有系列稀释样品的自动操作功能。以下为该产品说明书上的摘录：

7.3.6.5 样品稀释

需要时，病人样品的稀释由系统用N个稀释液，按多个稀释步骤自动完成（1:5、1:20、1:100、1:400、1:2000、1:8000、和1:40000）。在一些情况下，这样的处理是很必要的。

在BN II操作说明书中，有图示说明，在它们的散射比浊分析仪上，仪器自动进行样品稀释。如下图所示（图9）。     

图9、BN II免疫散射比浊分析仪样品自动稀释示意图

由此，说明了在免疫散射比浊分析仪上，样品多次被成倍稀释后再检测，检测结果的精密度，随着样品内被分析物的浓度越高，它的重复性就越有问题。这就是散射比浊的一个严重问题！相比之下，使用一般自动分析仪，几乎不存在检测前对样品进行如此的预稀释。进行免疫透射比浊确实会得到全世界的临床实验室人员的喜爱！方便和实在。

从所有实际的目的上考虑，免疫散射比浊与免疫透射比浊间对蛋白进行免疫沉淀方法的检测，相互间差异很小。从工作量考虑透射比浊，越来越普遍在，因为它可应用到常规的临床化学分析仪上。酶和底物测定，与蛋白检测结合。特别有优势，对尿液白蛋白的浓度，无论是散射比浊或透射比浊，都必须被标准化到其他参数，如肌酐。