【冯仁丰】免疫散射比浊法和免疫透射比浊法 1

免疫散射比浊法和免疫透射比浊法

（Immunonephelometric and immunoturbidimetric assays）

——光散射基础（Basics of light scattering）

冯仁丰

全世界的临床实验室，几乎都在一般临床化学自动分析仪上，以免疫透射比浊方法进行特定蛋白的检测。方法简易快速方便。现在的临床实验室大多已经忘记了近30年前，究竟进行特定蛋白检测是散射比浊好还是透射比浊好的争论。很多年轻人已经不知道还有散射比浊的专用检测分析仪。

当时使用抗原检测样品中某些特定蛋白，还有自动化专用仪器检测免疫复合物对入射光散射免疫比浊方法，在我的经历中印象深刻。我记得，孔宪涛前辈对Beckman的ARRAY仪器非常推崇。他对ARRAY仪器检测的那些特定蛋白结果坚信不疑！他对以后出现的免疫透射比浊方法，持有相当怀疑的看法。他坚持这不是比色测定！散射比浊是对免疫反应产生的抗原抗体复合物，在比色液中形成的浑浊程度具有散射光的能力进行的度量！一般的自动分析仪，检测的都是洁净的比色液，由于直射光部分被比色液内检测成分特异吸收，使余下的直射光减弱形成吸光度。这是自动分析仪的强项！对免疫产生的抗原抗体复合物造成的光散射，自动分析仪不能可靠检测！

可是孔老师没有想到，样品中的抗原与试剂中的特异抗体，在给定的反应条件下，形成的抗原抗体复合物颗粒太小，一般情况下，对入射光发生散射的能力很有限！如果不是当时很快引入使用合成的聚苯乙烯胶乳作为检测抗体的载体，将抗体共价结合到胶乳颗粒上，使样品中抗原与胶乳上的抗体，产生的抗原抗体复合物被，放大了许许多多！通过抗原抗体复合物的作用，将各个与胶乳上抗体的颗粒聚合在一起，这样聚合的聚苯乙烯颗粒，对入射光产生的散射能力增大到完全符合散射检测需要的散射光强度！而且，也为以后在自动分析仪上，直接使用免疫透射比浊方法奠定了基础。免疫散射比浊的发展，离不开使用聚苯乙烯作为抗体载体的贡献！

这也是，使免疫透射比浊方法具有的检测能力，与被聚苯乙烯颗粒放大作用的免疫散射比浊相当！临床实验室无需专门使用免疫散射比浊分析仪，即可进行各个特定蛋白的免疫检测！由于临床化学分析仪在全世界各个临床实验室的普遍使用，才使免疫化学的比浊方法检测特定蛋白，在世界各地普遍推广使用。

图1、增强免疫沉淀反应的胶乳-抗体颗粒示意图

对于这些免疫化学比浊分析方法，很多临床实验室工作人员，需要有更多的了解。

一、光散射

正如前述，临床实验室以抗体进行蛋白质抗原检测的方法，可追溯到20世纪的中期，使用检测液相免疫凝聚引起透过光的吸光度变化的方法。在免疫复合物形成复合物颗粒大小的增加，发生了比色中入射光被免疫颗粒的散射。

光散射是由于振荡电场与光以及原子和分子的电子相互作用而产生的。电场诱导分子中偶极震荡，转而产生相同频率的光发射。散射光的强度和方向依赖免疫抗原抗体复合物颗粒的极化率、形状和大小。极化率取决于散射颗粒的电子结构，以折射指数表示。

免疫复合物的大小并不是绝对值，复合物颗粒直径与入射光波长大小的关系，决定了散射的类型。散射光的强度分布，由抗原抗体复合物中颗粒大小与入射光波长间的比例关系决定。

产生散射光表现，前人研究大致可分为Mie或Rayleigh散射的情况：

-- 如果颗粒直径小于入射光的波长，会出现Rayliegh散射。

这种情况下入射光束被对称地散射到各个方向。无论在什么角度检测散射光强度的效果较差。

图2、Rayleigh光散射的表现

（产生光散射的颗粒直径＜＜入射光波长）。

-- 如果颗粒直径大于入射光的波长，会产生Mie散射。随着颗粒直径的增大，散射光束主要朝前方发散。这种情况能提高检测散射光的光学效率。

图3、Mie光散射的表现

（产生光散射的颗粒直径＞入射光波长。）

因为使用了乳胶颗粒，抗原抗体复合物直径保持在d＞1000 nm左右。BN II散射比浊分析仪使用的光源发射波长为840 nm的电磁波。由于使用了乳胶颗粒作为抗体的载体，它们的颗粒直径大于波长，因此主要产生光信号较高的Mie散射。

在Dati和Metzmann书上，还给出了如下的信息。

因沉淀反应改变了光的散射。依据沉淀颗粒的直径（d）和入射光波长（λ），决定了光散射的特性（图3）。

图4、不同类型的散射光，取决于颗粒大小。

若抗原抗体复合物颗粒直径较波长小，免疫复合物颗粒表现像一个点发射器，散射光呈对称性分布。被称为“Raleigh散射”。它解释了为什么天空在阳光下为蓝色。图中散射光等式说明：颗粒直径与散射光间具有6次方增加的关系，与波长呈4次方下降的关系，从数学上进行了解释。在免疫复合物颗粒大小接近发射光波长，会产生干扰现象，因为颗粒的不同部分如一个独立的光发射器。因此散射光的分布很少对称，散射光强度趋向前方。数学模式变得更复杂，直径能量减少。在免疫复合物颗粒大于波长下这些作用最显著，图示中被称为“Mie”散射为主导。分析散射光的空间分布，可应用到研究水合形式蛋白、碳水化合物、或完整病毒、以及有机多聚体等。

免疫散射比浊分析仅仅是检测了散射光的总强度。颗粒直径大小与散射光强度的关系，可见图5。