抗苗勒管激素：卵巢储备功能检测及其潜在的临床意义

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背景：女性的抗苗勒管激素（AMH）由卵泡发育早期阶段的卵泡颗粒细胞产生。AMH浓度在成年初期达峰值水平，之后随着年龄的增加逐渐降低，至原始卵泡耗竭时即绝经前5年内降至无法检测的低水平。然而，个体差异主要存在于卵泡池耗竭的速度和卵泡池的初始大小，这可以通过宽范围的绝经年龄反应出来。据此，相同年龄的女性其AMH水平可能明显不同，从而可以通过AMH来预测女性生殖寿命的剩余长度。

方法：经过10年来这一领域的激烈的临床研究（每年有超过300篇论文发表在核心临床期刊上），证明可使用AMH水平检测卵巢储备功能的证据水平迅速提高。我们对所有已出版的证据进行了总结综述。

结果：许多研究已经充分表明在各种临床情况下如不孕的治疗（尤其是试管婴儿）、生殖寿命的预测、卵巢功能失调（特别是多囊卵巢综合征）和性腺毒癌症治疗或卵巢手术，AMH是目前检测卵巢储备功能最好的方法。此外，AMH可能有助于卵巢刺激的个性化给药从而提高IVF的效率和安全性。但是，也有关于样品存储和处理技术方面等不同条件下AMH测定性能方面的担忧。因此，需要制定实验室和参比制剂方面的国际指南，以使不同实验室间测试结果具有可比性。

背景

性腺激素抗苗勒管激素（AMH）是一个140 kDa、由二硫键连接的同源二聚体糖蛋白，是生长和分化因子超家族中转化生长因子-β家族（TGF-β）中的成员之一，类似于抑制素和激活素。AMH，最初被称为苗勒氏管抑制物质（MIS），自1940年因其在早期胚胎发育的男性性分化过程中的作用被人们所认识，这归功于Alfred Jost的创举。 AMH由胎儿滋养细胞产生，诱导苗勒管的退化，使沃尔夫管在睾酮的作用下发育为男性生殖道。早在8周妊娠时即有AMH的睾丸生产。

在缺乏AMH的情况下，胚胎将发育成雌性，苗勒管分化成阴道上段、子宫和输卵管。然而，胎儿后期，AMH由驻留在卵泡内的颗粒细胞合成。在人类胎儿中， AMH的卵巢生产开始于分娩附近。窦状卵泡中AMH主要分泌到卵泡内引起卵泡液浓度升高。因为分泌的量足够大，所以可在循环中检测到AMH。

AMH作用涉及的分子机制与TGF-β中的其他成员类似。配体与AMHⅡ型跨膜受体的细胞外结构域特异性结合，通过细胞内Smad蛋白促使I型受体及其下游信号磷酸化。人类的AMH基因编码本身（位于第19号染色体）或它的第II型受体（12号染色体）均发现了基因突变。这样的突变（影响配体结合，信号转导和细胞内运输）常表现为常染色体隐性遗传，导致男性持续性苗勒管综合征。有趣的是，几个家族研究显示受累的姐妹们具有正常的生育能力。 AMH II型受体也存在于其他组织中（例如脑，乳房和子宫内膜），虽然其功能作用仍不清楚。

使用AMH基因敲除的小鼠进行的动物实验发现AMH在抑制休眠始基卵泡的生长方面具有重要的卵巢内作用。与野生型相比，AMH敲除小鼠原始卵泡招募增加。在4个月时，窦前和小的窦状卵泡数目增加。相反，年龄为4月和13月时，始基卵泡的数量显著降低。总的来说，这些观察结果表明，没有AMH的小鼠，始基卵泡招募速度更快，导致原始卵泡池的过早耗尽。因为AMH缺失小鼠表现出低水平的FSH且伴随生长卵泡数量增加，所以推测在没有AMH的条件下，卵泡对FSH更敏感。在卵泡对FSH的敏感性上，据推测AMH在优势卵泡选择的过程中发挥抑制作用。随着窦状卵泡增大，AMH表达减少，这可降低FSH的阈值水平，从而使卵泡继续生长并在接下来的周期排卵。但是，是否AMH这样的卵巢内旁分泌作用也同样存在于人类仍需证实。

人类卵巢组织的免疫组化证实始基卵泡中缺乏AMH染色，然而在初级卵泡、次级卵泡、窦前和直径小于4 mm的早期窦状卵泡中AMH高表达。AMH染色在直径4 mm和8 mm之间的卵泡中逐渐减退。最近的一项研究证实了这一发现，证明直径小于8 mm的卵泡的卵泡液中AMH基因的表达和总AMH蛋白增加，卵泡直径达8 mm后出现大幅下降。由此表明5-8 mm的卵泡分泌的AMH占循环中的60%。相反，超过10 mm的排卵前卵泡的颗粒细胞不能产生AMH。

在卵巢超刺激方案中（当大多数窦状卵泡发育为大优势卵泡），血清AMH水平显著下降。此外，随着年龄的增加，大卵泡增多，这可能也与AMH呈负相关。总之，末梢循环中的AMH主要源自窦状卵泡。因为这个数据与原始卵泡池呈比例关系，AMH可能间接代表卵巢储备。

次级卵泡招摹之前的早期卵泡发育在很大程度上不依赖促性腺激素。在正常月经周期的卵泡晚期AMH血清水平不受优势卵泡生长的影响。这使得AMH便于临床使用，与当前可用的卵巢老化的其他标记物不同，如抑制素B、雌二醇（E2）和FSH，这些标志物均依赖于月经周期，并且这些标志物是原始卵泡池耗竭过程的晚期标志物。

卵巢衰老与随着年龄增加卵泡池的数量和质量下降相关。初步研究提出AMH可做为卵巢衰老的一个假定的指标，年轻的排卵正常的女性随着时间的推移AMH水平下降证实了这一假设。也观察到AMH和经阴道超声评估的窦状卵泡数（AFC）之间存在强烈的相关性。随后在接受试管婴儿的妇女中发现AMH和年龄、AFC和FSH之间的相似关系。许多额外的研究证实随着年龄增加血清AMH水平下降。21岁及以上女性每年平均跌幅为5.6％。AMH间接反映原始卵泡池大小的有效性的进一步证据来自一项简明的研究，该研究中有42名妇女因良性妇科原因接受卵巢切除术。校正年龄后，AMH和AFC与存在于卵巢组织中的原始卵泡数量之间存在良好的相关性。

存在于卵巢衰老中的主要个体差异主要源于卵泡池耗竭的差异，与正常绝经年龄为40-60岁之间这一较宽的年龄范围相符。有些妇女在35岁可能比其他人卵巢衰老更快；即她的个人AMH浓度可以类似于45岁妇女的平均水平。最近几年已经形成了几个从出生到更年期血清AMH正常水平的列线图。总之，这些研究表明，AMH水平在青春期前的发育过程中较低，青春期早期上升，在20-25岁左右达到一个高峰，随后逐渐下降，至围绝经期检测不到。

现在还不明确为什么AMH水平在童年和青春期上升，但下丘脑-垂体-卵巢轴的变化伴随早期卵泡招募的动力学和卵巢生长的改变被提议作为最可能的解释。因此，AMH可能只能被用于评估年龄大于25岁妇女的卵巢衰老程度。

AMH检测

在2002年-2010年期间，在人类女性研究中使用两种不同的AMH检测方法。这两种检测是由诊断系统实验室（DSL）和Immunotech公司（IOT）同时开发的，采用的是不同的AMH抗体。直到今天，用于校准的AMH标准有不同来源，但尚未制定国际标准。IOT试验产生的AMH浓度较DSL高40%，这使得综合分析采用不同检测方法的研究变得困难。

2010年，两家公司合并于Beckman Coulter公司旗下，并开发出一种新的两步、夹层型酶、微孔板检测（AMH第二代检测法）方法。一种更稳定的抗体沿着IOT校准标准曲线被绑定到AMH的成熟区并且AMH水平可在20 ml血清中经3小时内进行测定。这种二代检测被校准到旧的IOT标准中，AMH水平与IOT检测相似，并较以前的DSL版本高出40％。这种二代检测比IOT检测灵敏度高2倍（0.08 ng/ml），抑制素A、激活素A、FSH和LH的交叉反应均低于检测的极限。

几项实验已对第二代测定法临床应用的可靠性进行了研究。这些研究已经确定了几个可能会影响测试结果再现性的因素。不同实验室间及样本储存稳定性间的检测内/间的差异有时可能受未知因素的影响。

关于新的测定法的重现性，在同一实验室进行测量的几项研究均显示检测方法间和批内的变异均很小（<5％）。然而，来自贝克曼的10个实验室使用同样的二代检测方法测试20个血清样本，实验室内重现性好，但实验室间的结果相对于共识值，表现出较广泛的平均值。这些差异可能代表了储存和运输条件的差异或酶联免疫吸附试验（ELISA）测试系统操作手册的工作差异。

关于跨样本的稳定性和重现性，研究得出了关于不同存储条件导致的变化相互矛盾的结果。第一项研究证实二代检测法具有很好的样本稳定性和重现性，即使在冻结和解冻后。然而这个结果并未经另一项研究证实。另一项研究表明样品之间的差异非常大，变异系数高达60％。几个因素可用于解释此差异。关于样本的存储和处理，研究证实在室温下保存7天的样品中的AMH血清水平增加。存储在－20度的样品AMH血清水平平均高23％，而存储在－80度的样品没有变化。样品不稳定的另一种解释可能是补体结合的作用。由于补体干扰，测试结果可能会低于预期值。这种风险在新鲜抽取的样本中最高。通过添加缓冲剂可能避免或最小化这种风险，最近的研究已经显示出有希望的结果。通过样品与测定缓冲液的预混合可能保持样品在所有温度下AMH的稳定性。此外，自动移液管或5小时内离心样品似乎可减少补体结合的影响。

最近公布了新的Anhs实验室的超灵敏AMH和picoAMH ELISA检测数据。这项研究表明此法与第二代法有不同的校准，但其性能适合于临床应用。ANSH实验室picoAMH法的高灵敏度可测量低浓度的AMH；然而，关于这种新的测定方法的稳定性需不同中心的进一步研究。

总之，关于AMH检测的稳定性仍没有确定的结论，特别是关于最佳的储存和处理条件，以及导致样本不稳定的补体干扰的作用。直到所有的这些因素都被彻底研究或自动检测开发出来之前，我们需要适用于所有实验室的如何存储样品和在相同条件下进行AMH检测的国际准则，使导致不同AMH结果的处理技术的影响不会改变临床治疗。此外，目前迫切需要建立一个国际参比制剂，使试验结果具有可比性。另一种可能是使用统一的样品而不是每个实验室可以衡量自己的测量。由于目前还不清楚是否我们可以直接将研究中的AMH水平转换到日常实践中，所以我们在临床实践中必须仔细转换研究中的AMH截点水平。

影响AMH水平的因素

AMH水平的变异也可通过生物变异来解释。AMH水平的内／间变化存在矛盾的结果。一些研究表明，这些变异有限并且仅仅代表偶然波动，可能与双侧卵巢窦状卵泡的数量逐渐变化相关。然而，其他研究已经证实月经周期中存在大幅波动，这会支持仅在早卵泡期测量AMH水平。尤其是年轻妇女中，数周时间段AMH的这种波动可能相当广泛，如果应用于临床实践需考虑到这种波动情况。

此外，我们必须考虑到取得样本的临床情况。研究认为AMH水平在用于避孕的外源性激素的作用下仍然恒定。包括2000名妇女的最近的大型队列研究已证明目前使用口服避孕药的情况下AMH水平下降。其他研究也证实了这样的影响。先前使用口服避孕药并不降低AMH水平，停止使用口服避孕药后，AMH水平甚至可能增加。这两个研究结果支持口服避孕药可逆性抑制AMH的作用。

研究也表明在黄体中期给予GnRH激动剂后的最初4周，AMH水平显著变化。这种观察结果表明，如果患者正在接受GnRH激动剂药物治疗，例如癌症的治疗，AMH可能不是卵巢储备的可靠标记。

最后，最近研究发现多种其他因素影响AMH的绝对浓度，包括超重、种族、维生素D状态、AMH的多态性及其受体和整个基因组的遗传变异。目前吸烟也与较低的AMH水平有关。这些观察结果的临床意义仍有待确定。

卵巢储备功能测定

卵巢储备功能测定旨在评估一个人的生殖潜力，可反应剩余卵母细胞的数量和质量。不断积累的证据表明综合考虑灵敏度和特异性，AMH是当前可用的最佳的测试，而不是AFC、FSH、E2和抑制素B的浓度。在生殖医学的不同领域通过AMH检测的卵巢储备功能测定可能有明显的临床益处。

普通人群生殖力和绝经期预测

在许多西方国家，妇女生育他们第一个孩子的平均年龄接近30岁。由于推迟生育的趋势仍在持续，显著比例想在30岁以后生育孩子的女性自然受孕的概率降低。准确的卵巢储备功能的测定可能会促使一些女性在较早的年龄开始组建家庭（或者通过卵母细胞冷冻方式申请保留生育功能），或者向其他女性承诺推迟生育不会干扰她以后实现妊娠的机会。

一项包括100名未经选择的想在30-44岁期间自然受孕的女性研究显示， 随访6个月期间，AMH初始浓度与自然生殖力间具有良好的相关性。这种相关性在病例数相当的年龄为20-35岁之间的年轻女性中未得到证实。需要更多的数据来得出AMH具有预测自然受孕机会的能力这一有意义的结论，特别是在年轻时。

据推测，自然不孕年龄与绝经年龄之间存在固定的时间间隔。最近，已经开展了几项关于预测自然绝经年龄的研究。在一项长期随访研究中，有257名妇女随访了11年。该研究表明使用年龄和AMH可个体化计算出随后发生绝经的年龄范围。其它研究已经证实了这些发现。这些结果已确定AMH可作为预测绝经期的有效生物标志物，虽然存在较宽的可信区间，特别对于年轻的女性。目前已有较大的队列研究，在该研究中AMH的预测作用与女性的年龄和其他潜在因素相结合，如体重指数和吸烟，将更加详细地确定其预测作用。

不孕夫妇妊娠机率的预测

女性年龄增加在不孕诊疗中变得越来越重要。卵巢储备功能检测可以更好的评估女性的生育潜能。据此可为女性量身定制治疗方案，其中可能包括对女性的预期管理，以取得良好的预后。近年来多种尝试被用于开发AMH浓度的年龄特异的列线图，研究涉及数万生育年龄的不孕妇女。虽然年龄特异的AMH水平可能有利于临床获益，AMH和FSH间的不一致结果导致的不安影响（1/18女性的不正常FSH需AMH水平再确定）仍有待解决，但主要强调这两个测试的不同性质。最终，需在不育夫妇中进行临床研究来确定无论是自然受孕还是以下的各种不育治疗方法后，与年龄无关的个体AMH水平与活产率的关系。

IVF中的患者管理

目前已发表多项关于使用卵巢储备功能检测如AMH来预测IVF结果的研究。至今已发表的有关AMH和随后IVF结果的大多数研究均在异质患者队列中进行。因此，关于AMH预测治疗结果的能力有相互矛盾的结论。其中一个重要的结局观察指标是对卵巢超刺激的反应。卵巢超刺激是IVF的一个组成部分，而且不考虑患者的个体特征，均采用统一的标准化方式。大多数应用的超刺激方案非常复杂，耗时且昂贵。经常发现卵巢对刺激的反应存在显着的个体差异，从一直反应低下或几乎没有任何反应（导致治疗取消或IVF结果不良）到过度的反应（与卵巢过度刺激综合征（OHSS）潜在危险相关）。此外，取得的卵母细胞的数目与妊娠存在相关性。几项研究已经表明9-13或6-15个卵母细胞的反应与最高的妊娠率或活产率相关。