解读：肿瘤个体化治疗检测技术指南

肿瘤细胞是否存在，是开展肿瘤个体化治疗基因检测的重要前提。如果要确认肿瘤细胞存在，与病理诊断医生密切合作是非常必要的。《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》指出：鉴定个体肿瘤的样本包括新鲜组织(包括手术和活检组织)、石蜡包埋组织、胸腹水等细胞学样本、血浆样本这4种类型。

肿瘤新鲜冷冻材料可提取出最高品质的DNA、RNA。在手术现场取样的情况也比较多，但需要在显微镜下确认肿瘤细胞含量。周围炎症严重的肿瘤、黏液产生过高的肿瘤、病变中心广泛纤维化的肿瘤细胞不能采集，以免产生假阴性结果。切割后取其中一半，并利用另一半切面制作组织标本，然后进行确认。

手术切除的组织样本理想的保存方法是迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80℃冰箱，这一过程应在手术样本离体后30分钟内完成。由于组织样本通常需先进行病理学分析，在分析完成后应尽早将组织样本置于稳定剂中，避免核酸降解。

10%中性福尔马林固定手术切除样本，按病理学操作规范进行取材。制作石蜡切片时，切取5片连续切片，其中1片进行HE染色，确认肿瘤细胞的含量。在高灵敏度检测方法中，可考虑使用活检标本。

DNA容易受固定的影响，长时间（1周以上）浸泡在福尔马林中的样本的DNA会被片段化，不能检出突变。活检材料的固定时间一般是24小时，对于穿刺等活检样本，固定时间控制在6~24小时为佳。

用胸腹水中的肿瘤细胞用于基因检测时，必须确认肿瘤细胞，穿刺获得胸腹水样本提交给细胞病理检查之后，剩余液体冷藏/冷冻保存，也可在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲液（AL缓冲液，Qiagen公司）等室温保存。由于细胞学样本的肿瘤细胞含量较低，因此必须使用高灵敏度检测方法。

循环DNA(circulating free DNA，cfDNA)是存在于血浆中的游离DNA，肿瘤来源的DNA占血浆游离DNA的比例在不同肿瘤及病例中相差悬殊（0.01~93%），从而限制了外周血在肿瘤分子检测时的应用。目前已有多篇文献证实可利用从血浆游离DNA检出突变，但需要使用ARMS法等灵敏度非常高的检测方法。

采集外周血提取血浆游离DNA进行检测，取样时应使用一次性密闭EDTA抗凝真空采血管，采集6~10ml全血，冷藏运输，6小时内分离血浆，提取游离DNA，保存到-80℃冰箱中，并避免反复冻融。如外周血需长时间运输，建议用商品化的游离DNA样本保存管，在常温条件下，cfDNA在全血中可稳定保存7天。

指南指出，肿瘤检测实验室按照《个体化医学检测质量保证指南》要求进行。在符合国家卫生计生委要求的个体化医学检测实验室和通过审核验收的临床基因扩增检验实验室完成。检测方法包括Sanger测序法、焦磷酸测序法（Pyrosequencing）、新一代测序（NGS）、扩增阻滞突变系统（ARMS）-PCR法、高分辨率熔解曲线（HRM）法、数字PCR（Digital PCR）、荧光原位杂交（FISH）、免疫组化（IHC）、荧光定量逆转录PCR(Q-RT-PCR)这9种方法。

Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准。

优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失；局限性是灵敏度不高，突变等位基因需要超过20%才能检出。对样本中肿瘤细胞的含量和比例要求较高，一般要求肿瘤细胞含量不低于50%，如果肿瘤细胞比例低于50%，则假阴性出现的概率会显著增加；不适用于活检或细胞学样本。

主要优点是检测灵敏度为10%，相对Sanger测序法高，对体细胞突变和甲基化等可实现定量检测；分型准确可靠，通量较高，实验设计灵活，可发现新的突变或遗传变异；局限性是测序长度较短，不能对长片段进行分析。检测灵敏度中等，难以检出低于10%的突变。不适用于活检或细胞学样本。

NGS又称大规模平行测序（MPS），包含多种可以一次性产生大量数字化基因序列的测序技术，是继Sanger测序的革命性进步，采用平行测序的理念，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标。不同厂家的产品测序原理不同，主要分为边合成边测序（SBS）、基于“DNA簇”和“可逆性末端终结”大规模平行测序、 4色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应测序和半导体芯片测序。

高通量测序技术不仅可以进行大规模基因组测序，还可用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选和DNA甲基化等相关研究。

高通量测序技术有三大优点是传统Sanger测序法所不具备的：第一，它利用芯片进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序；第二，高通量测序技术有定量功能，样品中DNA被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度；第三、利用传统Sanger测序法完成的人类基因组计划总计耗资27亿美元，而现在利用高通量测序技术进行人类基因组测序，测序成本只需1千美金。

局限性是检测灵敏度和测序深度相关。一般来说，NGS在肿瘤体细胞突变检测时，检测灵敏度为10%；已知的与肿瘤相关驱动基因数量有限，疾病表型和基因型的关系还有赖于生物信息的解读，目前NGS应用于肿瘤细胞突变检测的标准化和质量控制尚未形成共识。

扩增阻碍突变系统（ARMS）是PCR技术应用的发展，也称等位基因特性PCR（AS-PCR）等，用于对已知突变基因进行检测，是目前实验室常用的基因突变检测方法。

主要优点是ARMS-PCR法检测灵敏度高，可检测肿瘤细胞中突变比例为1%甚至更低的突变基因；局限性是只能检测已知的突变类型，不能发现一些新的、未知的突变；如果检测的突变位点或类型较多，则随着引物数目增加出现非特异性结合的概率也相应增加；当检测位点较多时，对DNA样本量的需求增加。

高分辨率熔解曲线（HRM）是一种基于PCR新型技术，用于检测基因变异包括未知的基因变异、单核苷酸多态性以及基因甲基化。HRM是基于在加热过程中双链变性为单链的原则，其分析不受碱基突变位点和种类的限制，可用于突变扫描、基因分型、序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。