核酸检测作为新冠肺炎疑似病例的确诊依据,在疫情防控中发挥着至关重要的作用。“内标”基因作为体现核酸检测质量的重要指标之一,能够对采样、提取、扩增等多个环节进行监测,可作为室内质控的有力补充。
目前NMPA批准的所有新冠病毒核酸检测试剂均包含“内标”,可分为“外源性”和“内源性”两种。下面结合实验室常遇到的样本“内标扩增异常”情况,和大家探讨一下在质控满足要求时,如何正确的认识核酸检测中的内标基因。【1】外源性内标
可能原因:无法明确是否存在检验前问题,多数为内标样本错加漏加、核酸加样时错加漏加;若连续多个样本存在此情况,首先考虑提取试剂、提取仪的问题。
常见原因:应先明确靶基因是否同内标基因存在竞争或抑制作用,若不存在,原因同上,且该扩增孔可能存在污染。常见原因:外源性内标最大特点为均匀性好,故个别样本内标离散时多为反应体系中存在抑制物;部分连续样本内标离散时,应首先考虑提取试剂、提取仪的问题;若整板样本内标离散时,多为扩增体系配置时未充分混匀。下图为因磁珠残留、加热模块异常,造成多个连续样本内标基因离散更换试剂、耗材、仪器等条件进行复检;重新采样检测并严格按照SOP操作等。内源性内标有典型扩增曲线并不代表采样成功,原因有:①对于混采样本,只需1个受检者采样成功,内源性内标就会有扩增;②如不能正确采样,仅采集口腔甚至皮肤样本,也会有内源性内标扩增;但需指出的是,采样不成功时,内源性内标一定无扩增。
常见原因:实验室较为常见,涉及范围较广,包括检验前样本采集、保存、运送问题;检验中反应体系、提取、扩增问题以及人员操作问题等。常见原因:此情况极为少见,因内源性内标基因与靶基因通常无竞争或抑制作用,因此原因同上,且该扩增孔可能存在污染或非特异性扩增。
常见原因:由于采样质量直接影响内标扩增结果,故曲线较离散属于正常情况,并不一定是人员不规范操作所引起。
若排除检验前问题,整体内标曲线相对离散,可能由于样本未充分振荡混匀或扩增体系配置时未充分振荡混匀。
更换试剂、耗材、仪器等进行复检;重新采样检测并严格按照SOP操作等。①提取仪异常导致提取效率低,多为加热模块故障、磁珠异常或磁珠残留;③不同采样管内的保存液对提取试剂的提取效率有影响。
常见原因:多为错用扩增程序,如A试剂反应体系使用了B试剂的扩增程序,可重新选择正确的荧光通道。
不同形式的内标各有利弊,目前有证新冠病毒核酸检测试剂既有采用外源性内标的方式,也有采用外源性内标的方式。因此,实验室可根据具体使用需求和应用场景来科学看待并灵活选择。
核酸检测中的每一环节都有可能影响检测结果,如内标曲线出现异常时,应细心分析并明确其原因,以更为有效地保证新冠病毒核酸检测质量,为疫情防控保驾护航。