核酸提取前加入蛋白酶K预处理，提取效率会更高吗？

归去来兮 2022-5-13 03:38 PM 1819人围观技术

作者：王晓燕

单位：同济大学附属东方医院胶州医院

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）肺炎作为突发公共卫生事件，传播迅速广泛，已严重危害人类健康。因RT-PCR具有快速、简便、特异度好、灵敏度高、成本较低的优势，已成为SARS-CoV-2核酸检测的主要技术。然而，在实际的实验室检测中，患者的阳性检出率仅为30%~50%^［1－3］。

在临床实践中，利用蛋白酶K（PK）进行标本的预处理，提高核酸提取效率，从而提高阳性标本检出率是常用的方法。而关于PK预处理是否可以提高核酸提取效率，国内外所做研究报道较多，但结论并不一致。下面就核酸提取前是否需要加入PK预处理进行实验并探讨其应用。

实验设计

本实验选取60例鼻咽拭子标本，其中单采样本20例、10合1（10-in-1）混采样本20例、20合1（20-in-1）混采样本20例，进行PK预处理和未处理的磁珠法提取、RT-PCR扩增的内源性内参GAPDH基因循环阈值的统计分析。

实验结果

图1 单采样本未处理（左）和PK预处理（右）的RT-PCR内源性内参（GAPDH）扩增曲线

图2 10-in-1样本未处理（左）和PK预处理（右）的RT-PCR内源性内参（GAPDH）扩增曲线

图3 20-in-1样本未处理（左）和PK预处理（右）的RT-PCR内源性内参（GAPDH）扩增曲线

表1 各种样本PK预处理和未处理的RT-PCR内源性内参（GAPDH）的CT值统计资料

实验结论

图1、图2和图3显示，单采样本、10-in-1混采样本和20-in-1混采样本PK预处理和未处理，均能有效扩增GAPDH内参基因；表1显示，单采样本、10-in-1混采样本和20-in-1混采样本PK预处理和未处理的GAPDH内参基因循环阈值进行分析，差异无统计学意义（P>0.05）。

实验讨论及文献查阅

蛋白酶K（PK）可对生物标本中的蛋白质进行消化，同时还可降解标本中的RNA核酸酶，阻止RNA被降解，对标本进行PK预处理可能会提高核酸的提取效率，从而被广泛应用于RT-PCR中。

杜栩彬^［4］等研究表明采用蛋白酶K处理粪便标本进行新冠核酸检测的敏感性优于未灭活处理和56℃水浴灭活处理；

KHELAIFIA等^［5］对粪便标本中细菌DNA的提取中指出PK的预处理可提高DNA获得率；

还有研究表明在甲型流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒的痰液标本进行预处理的研究中，其结果均显示PK的预处理较未处理有更高的提取效率^［6-7］。

新冠核酸检测的专家共识^［8］、工作手册^［9］和防控方案^［10］中，均指出痰液标本的处理时PK的临床应用。

但也有文献报道^［11］，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统对SARS-CoV-2鼻咽拭子标本和粪便标本进行提取时，PK的预处理对核酸检测结果没有影响；

GOLDSCHMIDT等^［12］则在对感染性病原体DNA提取的预处理一文中提出，在某些病原体的提取中，PK的预处理没有必要；

JEDDI等^［13］研究寄生虫病和真菌病 DNA提取优化的分子诊断研究中，提出由于NucliSENS easyMAG磁珠提取系统中裂解缓冲液具有高解离活性，使PK在大多数情况下是可有可无的，以上结论均与本研究结论相符。

综上所述，造成这些结论不一的原因可能有如下几点：

（1）PK的比活性存在一定差异；

（2）寄生虫、细菌、病毒等不同病原体对PK的预处理效果存在差异；

（3）不同的标本类型及提取方法可能影响PK的预处理效果。因临床复杂样本（深部咳痰和气道抽取物）不易获得，而且本研究样本量和样本类型（鼻咽拭子）存在局限，所以PK预处理在RT-PCR中的应用应综合考虑。

但就磁珠法提取、RT-PCR扩增的单采、混采鼻咽拭子标本，可无需进行PK预处理，这在一定程度上节省了实验时间和实验耗材。

蛋白酶K知识拓展

蛋白酶K是蛋白酶的一种，属于碱性丝氨酸蛋白酶类，来源于林伯氏白色念球菌（Tritirachium al⁃bum Limber）。

首次由Hennrich于1973年报道，因其能降解角蛋白，故命名为蛋白酶K；1974年Ebeling等通过凝胶过滤大致确定其分子质量为（18 500±500）Da，等电点（pi）为8.9，最适pH在7.5~12.0，是一种碱性蛋白酶。

Jany在1985年报道了蛋白序列， Pahler在1984年报道了晶体结构，Gunkel在1989年报道了蛋白质大小。蛋白酶 K的基因有2个外显子和一个内含子；蛋白质结构由信号肽、前导肽和成熟肽组成。

蛋白酶K具有2个Ca²⁺结合位点，用乙二胺四乙酸螯合蛋白酶K中的Ca²⁺，处理3h其活性降低50%，而加入Ca²⁺复性处理，其酶活只有初始酶活的28%。此外，其成熟体还含有典型的丝氨酸蛋白酶类催化三联体结构（Asp 39-His 69- Ser 224）和两对二硫键。蛋白酶K对尿素具有较强的耐受性，低浓度SDS对其活性影响较低，高浓度影响较大，PMSF对其活性具较强的抑制作用。

蛋白酶K被发现以来，有研究者不断被对其结构、性质进行了报道，并实现了蛋白酶K的异源表达（主要是大肠杆菌和毕赤酵母）。此外，研究者们还对如何提高蛋白酶K的表达量、比活性，以及最佳适用量与处理时间（如在原位杂交中的最适用量与处理时间）等方面进行了研究，极大程度地促进了蛋白酶K在工业与科研中的应用。

专家点评

李玉杰，主任技师，同济大学附属东方医院胶州医院检验科主任

新型冠状病毒肺炎（COVID-19)的早期实验室诊断可及时隔离患者及其密切接触者，切断传播链。同时，早期诊断和治疗可使患者有更好的预后。目前，新冠核酸检测受到采样时机，标本类型，标本保存转运，试剂检测限，核酸降解，PCR抑制等各方面的原因，其阳性率一直不理想。多中心研究表明，PK预处理在处理复杂样本中可提高核酸提取效率，各类指南、政策文件也明确提出了PK预处理的临床应用情况，各个核酸检测实验室应严格遵照执行。

【参考文献】

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［9］《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）》

［10］《新型冠状病毒肺炎防控方案（第九版）》

［11］王念，巫丽娟，周易，等．蛋白酶 K 预处理在SARS-CoV-2核酸提取中的应用探讨［J］．国际检验医学杂志，202 1,41(1):30-33.

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来源: 检验之声

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