Nature | Broad Institute成功开发CRISPR组合测试，可用于SARS-CoV-2变体和呼吸道病毒 ...

Broad Institute和其他组织的研究人员已经开发出一种高通量的多重CRISPR组合测试，用于检测SARS-CoV-2和新出现的SARS-CoV-2变体以及其他呼吸道病毒，目的是解决核酸测试和下一代测序平台的一些限制。

合作者最近在Nature Medicine杂志上发表了他们的临床评估结果，描述了该组合测试的开发过程和应用范围，其可用于检测SARS-CoV-2、其他冠状病毒、甲型和乙型流感，以及识别和区分六个SARS-CoV-2变异系--Alpha、Beta、Gamma、Delta、Epsilon和Omicron。

据Broad Institute的测试开发者和Nature Medicine论文第一作者Nicole Welch说，该小组的总体目标是帮助缩小“临床诊断和测序之间的巨大差距”。

这个新平台被命名为mCARMEN，用于核酸多重评估的微流控组合阵列反应，将CRISPR技术与微流控技术相结合。研究人员写道：“据我们所知，mCARMEN是唯一一种将监测能力结合到单一技术平台的诊断方法，它能够在一天内对数百个样本进行多种呼吸道病毒和变体的检测，同时还能对病毒基因组拷贝进行定量。”

Welch补充说，该平台提供了四到五个小时的周转时间，可与基于RT-PCR的SARS-CoV-2诊断测试相媲美，而且远比用于变异体监测的测序技术更快、更便宜。

她指出，mCARMEN在不到一天的时间里就能检测并识别出变异体，每个样本13美元，大约是基于测序的变异体识别成本的十分之一，后者可能需要7到14天才能提供结果，对于SARS-CoV-2诊断测试来说太慢了，也不是变异体监测的理想选择。

总的来说，该平台的组合测试可以检测21种呼吸道病毒，从而有可能对出现难以解释和区分的呼吸道症状的病人进行全面检测。

根据Nature Medicine的研究，mCARMEN的呼吸系统样本在学术环境中的525个病人标本和马萨诸塞州总医院的166个标本中显示了诊断级的性能。

它还在2088份病人标本中发现了6个SARS-CoV-2变异系，在该样本中加入Cas13和Cas12酶后，可以定量测量样本中的SARS-CoV-2和A型流感病毒拷贝。

Welch说，在市售的Fluidigm Biomark X微流控系统上使用集成流体电路和部署机器学习来设计高活性CRISPR RNA分子是她和她的合作者开发的方法的关键。

她说，为了进行CRISPR检测，CAS核酸酶与高活性CRISPR RNA分子结合，并以其为指导，瞄准感兴趣的特定序列。当CAS核酸酶与目标序列结合时，它会裂解附近的荧光报告器，这些报告器释放出光信号，表明病毒序列的存在。

在2018年开发的第一个概念验证原型（名为CARMEN）中，研究小组利用Cas13核酸酶在一个阵列上测试了4500多个crRNA-目标对。Cas13-crRNA复合物被分离和限制，以便在成对的液滴组合之前进行条形码和乳化，从而通过荧光显微镜进行检测。这种方法同时检测了8个样品中的169种病毒，但产量低，需要定制成像芯片和读出硬件。

当COVID发作时，研究人员决定通过添加关键病毒来改造组合，并寻求开发一个可以广泛使用的技术版本。按照目前的情况，该平台可以在其他实验室建立和使用，但这个过程“需要大量的时间和精力”。

这项研究的资深作者，Paul Blainey建议研究人员调整该技术，使之与Fluidigm微流控平台一起操作，该平台可使某些步骤自动化。据Myhrvold说，Fluidigm平台的加入使原本手工操作的过程实现了自动化，比如制作和混合单个乳剂，为显微镜下的成像做准备。

总部位于加州南旧金山的Fluidigm公司的CSO Andrew Quong说：“这项研究证明了 利用最新CRISPR技术的mCARMEN平台与Fluidigm微流控技术相结合的力量，而且Biomark X实时PCR平台可以在全球范围内轻松部署，用于传染病监测。”

mCARMEN现在由自动RNA提取、用于扩增的热循环、微流控芯片和一个大型台式读数器组成--这个平台的大小与基于实验室的大型RT-PCR测试系统相似。

通过Biomark X，mCARMEN可以用96种不同的检测方法测试96个样本的独特组合，或用192个样本测试多达24种不同的病毒或变体。研究人员说，微流控仪器还能优化呼吸系统组合，使其变得易于使用，并将得出结果的时间缩短到5小时以内，而原来的平台则需要8到10小时。

在这项研究中，该小组比较了mCARMEN和其概念验证原型的性能，以检测代表21种病毒目标的合成DNA片段。两个版本都有100%的分析特异性，但mCARMEN对102 copies/μL的敏感度是100%，对101 copies/μL的敏感度是98.4%，而早期版本的敏感度分别为86%和77.8%。

此外，在麻省总医院对存档的临床和人工标本进行的测试中，与分子诊断测定的结果相比，呼吸道病毒小组对所有病毒目标的阴性预测值为100%，阳性预测值大于95%，人类偏肺病毒除外。

当其他临床研究人员在麻省总医院验证该平台时，Welch开始将其用于SARS-CoV-2变体的检测，并开发了一个与呼吸系统组合整合的组合，因此，当出现新的变体时，不需要大规模重新设计检测。

该变体样本通过检测广泛的单核苷酸多态性捕捉独特的突变模式或指纹，并补充说，因此mCARMEN可以根据特定指纹的普遍性快速标记样本，从而使测序工作能够确定变体谱系。

在Omicron变体出现后不久，哈佛大学的CLIA认证测试实验室和马萨诸塞州公共卫生局开始向Welch发送样本，Welch使用mCARMEN检测该变体。

Welch说：“很多合作者和第三方关系都对使用mCARMEN进行呼吸道病毒检测、新出现的变体识别或在未来检测血液传播的病原体感兴趣。”

罗德岛卫生部、美国疾病控制中心、美国国防部的国防高级研究计划局以及非洲基因组学和传染病卓越中心都是与Welch及其同事合作的合作者之一。

在驯服COVID-19大流行的努力中，其他一些开发者已经转向CRISPR技术来检测SARS-CoV-2病毒，包括加州大学圣地亚哥分校，以及位于马萨诸塞州剑桥的Sherlock Biosciences，该公司的Sherlock CRISPR SARS-CoV-2试剂盒获得了FDA的紧急使用授权，该试剂盒设计用于高容量的CLIA实验室和医院。

Myhrvold说，2020年，Broad研究所的研究人员还向FDA申请了作为实验室开发的测试的呼吸系统组合的EUA，但该机构当时表示，它已经对在单一实验室进行的测试进行了优先排序，并没有审查该申请。

该小组将继续关注FDA的优先事项，并可能决定申请一项包括变异样本的新授权。

参考文献

Welch, N.L., Zhu, M., Hua, C. et al. Multiplexed CRISPR-based microfluidic platform for clinical testing of respiratory viruses and identification of SARS-CoV-2 variants. Nat Med (2022). https://doi.org/10.1038/s41591-022-01734-1