【冯仁丰】系列讲座 6 基质和基质效应临床实验室认识和实践 4 ...

基质和基质效应临床实验室认识和实践

冯仁丰

五、我开始认识基质和基质效应

上世纪80年代，上海市临床检验中心（原上海市医学化验所）为了在上海开展质量控制，自行开发制备控制品。为了防止血清内α脂蛋白在冷冻干燥过程中，因脂蛋白变性使血清在冻融后产生浑浊，在加工中必须首先以葡聚糖硫酸钠沉淀去除脂蛋白，方可使冻干后的血清制品复溶后没有沉淀，非常清晰。然后，经透析等步骤后，重新加入不少低分子的物质，包括肌酐。按照血清体积，计算需要添加的肌酐量后，将称量的肌酐直接倒入血清，搅拌后取样，以苦味酸方法检测回收量。但是，每次对肌酐检测加入前后的样品，总是发现最后得到的肌酐含量，仅是加入量的85%~90%。

是什么原因造成肌酐含量的下降？

1993年，我在中美临床实验室交流第一次会议上，听到了Dr Fred Lasky的报告。他介绍的就是基质和基质效应。我顿时被报告吸引了。原来在对血清内某个分析物检测时，在分析物周围的非分析物（即该分析物的基质），对检测结果有显著影响。被称之为“基质效应”。我立刻就想到，原来的肌酐检测，应该是去除蛋白后再行检测的，这可以完全消除了蛋白对肌酐检测的影响。因此，可以使用以水配制的肌酐标准，以苦味酸方法检测。现在，进行血清的直接检测，明显地受到血清内蛋白的严重影响。蛋白对肌酐检测的影响完全可以称之为基质效应。

因为，以肌酐水溶液为标准，进行血清不除蛋白的肌酐检测时，蛋白作为肌酐检测的基质，它们对肌酐检测结果的可靠性有着严重的影响。因此，我在配制检测用的肌酐标准液时，不再以水配制，而是直接采用透析完成、即将加入各个添加分析物的血清。这样在检测时，可以将未添加肌酐的血清为自身空白，将添加过肌酐的血清检测吸光度减去未添加肌酐血清的检测吸光度，即为添加肌酐参与苦味酸反应的吸光度。按照这样的做法，加入肌酐的回收率为100%。

这是我第一次从基质和基质效应上得到的好处。我写了文章基质和基质效应。但是，当时根本没有考虑到原始混合血清与加工处理过的血清间有什么差异。采用控制品的检测结果与天然血清检测结果间的差异，在以后的工作和文献报告中越来越明确。这就是今天最关注的基质效应的问题。当时，Dr Fred Lasky是Ortho 公司的高级顾问。后来他发表的文章，更加说明了如何在为校准品定值中，克服基质效应的做法。现在可以阅读他写的EP14文件，关于基质和基质效应。

随着自动化检验在临床实验室的广泛应用，实验室开始意识到，不可再以手工操作的那样做法，去进行自动化检验。其中最重要的一个是，以往过去手工操作一直将纯物质以水或溶剂配制成标准液，将它像病人样品那样也进行检测后，以它被检测的吸光度等作为确定样品被无蛋白血滤液后再检测内含被检测分析物量的标准。但是，现在分析仪直接检测血清等样品后，计算得到的病人样品检测结果不准确。实验室认识到，标准液内的分析物与样品内的分析物在直接检测中，处于不同的基质环境。

采用真实的病人血清作“标准”（校准品），校准检测系统，再由该检测系统去检测病人血清，以此克服标准液和真实血清间的基质效应。但是，该“标准”血清内也含有要检测的分析物，它的浓度为多少？需要采用检测系统先检测。不同的检测系统（方法学、检测程序）对该“标准”血清的检测结果不同。因此，校准品的定值一定与检测它的系统有关。即：校准品的值依赖于检测系统；也一定没有各个检测系统通用的校准品。在疾病控制中心等实验室，他们对各种样品的检测，因为不同来源的样品很复杂，本身引入了样品的基质差异。为此，他们对每个样品进行三个实验检测：A、样品；加检测试剂。B、样品加标准液；加检测试剂。C、样品空白；加空白试剂。这样，以空白校0；检测样品和检测样品加标准的显色。以B检测信号减去A检测信号；为标准信号D。将A检测信号除以上述D信号，再与标准浓度相乘，即为该样品的分析物结果。这个方法非常实在。可惜，每个样品均需要做三个检测，非常费时。临床实验室无法实现。

克服标准和样品内分析物所处基质环境不一引起的检测差异。这样的做法应该讲是最佳的。但是，10个样品需要10个对应标准液，10个对应空白！1000个样品就需要1000个“标准液”！增加了实验室大量负担。这个做法在疾病控制中心对不同类型样品的检测，就是这样做的。结果说明非常有意义。可是实验室每天的样品量很大，这样的操作无法承受。最终，可以用于自动化检测的校准品，只能使用处理过样品。面临的问题是，如何对这样的校准品给予定值？Fred Lasky的报告是正确对校准品定值的做法。

临床检验结果的准确度是检验可靠性的重要方面。为此，政府机构强调实施室间质量评估计划 (proficiency testing or external quality assessment)作为评价各实验室正确度的依据。但是，现有数据说明，简单地从室间数据说明准确度不一定可行。下发的各种室间调查用的控制品(controls)，都经过加工处理。例如，冷冻、冷冻干燥、加稳定剂、添加某些分析物等，都是处理过的样品(processed sample)。这亦包括室内控制用的控制品和校准品(calibrator)。它们都不是日常检验的病人新鲜标本 (fresh specimen)。

本文件提供的导则，评价在比较两个检测程序时，因样品基质（生理的或人为的）使分析物检测的偏移。

因此，EP-14的文件只是揭示了处理过样品，相对于人的新鲜病人标本，具有显著的基质效应，由此产生了检测偏移。由于这些基质效应，以室间调查来评价检验正确度，若不重视会导致不正确结论，甚至会带来不应有的行政处理。基质效应涉及各个检验专业项目，表现有所不同。在分析中，仪器设计、试剂组成、方法原理、控制品、校准品、室间调查材料的组成和处理技术是产生基质效应的因素。它们间的互相作用又使基质效应变得更为复杂。对这类基质效应的观察，是了解某检测系统（包括方法学、仪器、试剂、操作程序等）在检测处理过的样品时，和病人新鲜样品结果间具有不同的偏移大小。但是，只用一种检验方法检测处理过的样品和病人样品标本时，无法看出这种偏移。

该文件的实验方法可以使实验室知道：使用的校准品、控制品、或室间调查样品等的“处理过样品”，在实际使用中，它们的表现是否与新鲜病人标本“一致”，即是否具有互换性。但是，究竟在实际应用中，我们是怎样做的？这需要弄清楚。

Fred Lasky起草的EP14文件，为临床实验室揭示了处理过样品，与人的新鲜病人标本相比，在进行分析物检测中，出现了明显的基质差异，即基质效应。这是使用处理过样品引入的偏移。提示大家注意。但是，这个基质效应该怎么处理和应对？临床实验室需要的是，如何确保临床病人的新鲜标本做出可靠结果！也即，如何让所有病人标本检测结果的高低，确实如实反映病人疾病状态和治疗效果？其实，在Rej的许多论文中，反复强调的是，我们需要检测结果的互换性（Commutability）。

之后的文章，我也将和大家一起学习有关检测结果互换性的内容！