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主任提问:核酸检测过程内源性内标起线就是采样成功吗?

归去来兮 2022-2-16 04:33 PM 1771人围观 技术

新冠疫情不断蔓延,核酸检测在疫情的防控中发挥着至关重要的作用。为了监测「提取、扩增」等环节,目前市场上已有多个产品均在核酸扩增试剂内加入了「内标」,包括「内源性内标」和「外源性内标」,两种方式各有利弊。


「内源性内标」的一个优势就是可监测「采样」[1]。这样的说法并不能完全囊括所有的临床场景;例如:在「单检」过程中,内源性内标仅能监测采集到足够人体细胞,不能判断采样部位是否正确;其次,在大规模「混检」中,标本漏检也难以发现。


因此,在实际工作中应根据实际情况,选择合适的试剂;并且无论使用哪种内标的扩增试剂,都需要保证采用过程的规范化。



「内标」、「内源性内标」和「外源性内标」是什么


在检验工作中,如 PCR 扩增靶标基因扩增呈现「阴性」,存在哪些可能性呢?


可能受试者为「真阴性」,也可能是由于采样、提取和扩增阶段存在问题,导致的「假阴性」[2]。各个厂家为了减少「假阴性」的发生率,通过改变核酸扩增试剂的配置,可通过检测内标核酸是否「起线」,判断是否存在「采样、提取、扩增」导致的假阴性。


内标分为「内源性内标」和「外源性内标」,两者的分析比较如下表 [3]:


图源:检验医学


「外源性内标」可更好监测提取、扩增过程:


外源性内标是在扩增体系中的提前加入的「定量」核酸分子,扩增中 Ct 值的变化幅度较小(某产品内标 Ct 值为:30 ± 1),因此当外源性内标扩增 Ct 值明显变大时,提示核酸提取不足,或反应体系中存在抑制物等。


然而内源性内标是人体的管家基因,随着采集的人体细胞加入反应体系,扩增反应的 Ct 值较大时,可能的原因不仅包括核酸提取不足、反应体系中存在抑制物等,也可能是由于并未采集到足够的细胞。



扩增过程中,某样本内标的 Ct 值升高。


可能原因分析:

  • 外源性内标:该样本核酸提取不足,或反应体系中存在抑制物
  • 内源性内标:该样本核酸提取不足,或反应体系中存在抑制物,或未采集足量细胞


「内源性内标」起线≠采样成功

试验方案 1

纳入了健康志愿者 10 名,分别口咽拭子采集人体口腔标本,使用「内源性内标」扩增试剂,「内源性内标」扩增结果如下图所示,1 ~ 9 号样本 Ct 值为 20.0~28.1,10 号样本 Ct 值为 24.8;所有样本「内源性内标」均起线,10 号样本并未见明显异常。

1 ~ 9 号样本

Ct 值:20.0 ~ 28.1


10 号样本

Ct 值:24.8


事实上,1~9 号样本在采样过程中,严格按照 SOP 操作采样,可以认为是采样成功的样本。10 号样本取样未按 SOP 操作,采样拭子仅碰及志愿者上颚,可以认为是采样失败的样本。


根据以上实验我们可以认为,在「单检」场景下,「内源性内标」起线,不能说明采样过程合理规范,采样部位准确可靠。

试验方案 2

试验对象均为健康受试者,通过采集志愿者口腔标本,制作「10 混 1」的混检样本共计 11 个,分别为 11 ~ 21 号样本。所有标本使用「内源性内标」扩增试剂,「内源性内标」扩增结果如下图所示,11~19 号样本 Ct 值为 22.8 ~ 28.2,20 号样本 Ct 值为 25.8,21 号样本 Ct 值为 26.0;所有样本「内源性内标」均起线,20 号和 21 号样本并未见明显异常。

11~19 号样本

Ct 值:22.8~28.2


20 号样本

Ct 值:25.8


21 号样本

Ct 值:26.0


事实上,11 ~ 19 号「10 混 1」的样本中,均加入了 10 个严格按照 SOP 操作采样的标本,可以认为是采集成功的样本,并未漏检。而 20 号样本中混入了 1 个空拭子,21 号样本中混入了 2 个空拭子,可以认为是漏检了 1 个或 2 个受试者的样本。

根据以上实验我们可以认为,在「混检」场景下,「内源性内标」起线,不能说明采样过程合理规范,采样依然存在漏检风险。


小结

综上,「内源性内标」和「外源性内标」扩增试剂各有利弊,我们需要根据具体的应用场景,不同的检测样本,选择合适的扩增试剂。另外「内源性内标」起线,说明采集到了足够的人体细胞,但并不能说明采样规范合理;在新冠疫情依然存在的今天,我们每一个人均应积极配合医务工作人员,保证采样的规范合理,共同为疫情防控努力。


参考文献

[1] 关于进一步加强奥密克戎等新型变异株疫情防控工作的通知

[2]Estimating the false-negative test probability of SARS-CoV-2 by RT-PCR. Euro Surveill. 2020 Dec17; 25(50): 2000568.

[3] Reference genes inreal-time PCR. J Appl Genet. 2013 Nov;54(4):391-406. 


来源: 检验医学
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