儿童呼吸道感染微生物检验标本采集 转运与检测建议（病毒篇） ...

1    标本类型及采集方法

1.1　总则　儿童急性呼吸道感染病毒病原诊断通常采用呼吸道标本，上呼吸道标本主要包括口咽拭子、鼻咽拭子（nasopharyngeal swab，NPS）、鼻咽吸取物（nasopharyngeal aspirates，NPA）；下呼吸道标本主要包括痰液、气管吸取物、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）等。上呼吸道标本检出病毒能否真正反映下呼吸道感染病原尚有争论［1-2］，但是由于儿童下呼吸道标本的获得存在一定困难，因此常用鼻咽吸取物和鼻咽拭子代替下呼吸道标本。

病毒感染后，机体的排毒量和排毒时间不仅与病毒种类、所累及的器官或系统有关，还与患儿年龄和免疫功能状态等宿主因素有关［3-4］。对于多数病毒性急性呼吸道感染，病毒的排泌发生在症状出现前，病毒量在症状出现后迅速增加，之后逐渐下降，因此，标本应尽快采集。但在免疫功能低下的感染者，较长时间内都可能检测到病毒［5］。建议尽可能采集多种类型的标本和（或）连续多个时间点采集不同部位的标本，以满足多种检测方法的联合检测［6］，同时要注意标本采集量，标本量过少时不宜进行多项检测，应首先保证主要项目的检测。

1.2　标本采集前准备

1.2.1　收集器和容器　采集标本的收集器和盛放标本的容器须经灭菌处理。灭菌宜采用压力蒸汽法等物理灭菌方法，不得使用化学消毒剂灭菌。若标本用来做核酸检测，容器不可含核酸酶，以防止核酸降解；容器内预装具有防核酸降解功能的保存液，有利于标本保存和转运。

1.2.2　病毒运输液（virus transport medium，VTM）　除分子诊断外，易干燥的病毒样本（如咽拭子）必须采用VTM或其他相应的缓冲液保存样本，以维持病毒颗粒的效价和病毒抗原的稳定。VTM可由实验室自行配置或购买商品化产品。

1.2.3　其他　采集人员应注意手部卫生，戴手套和口罩，做好必要的个人防护。采集鼻咽吸取物和支气管吸取物标本时要准备无菌吸痰管和中心负压或电动吸引装置。检测血清病毒抗体时需要采集血标本，应准备相应的无菌试管和注射器。

1.3　呼吸道标本采集方法

1.3.1　咽拭子　包括鼻咽拭子和口咽拭子。多数呼吸道病毒的主要感染复制部位为后鼻咽部纤毛柱状上皮细胞，其次为前鼻孔和口咽部纤毛上皮细胞，因此，鼻咽拭子的病原检出率较口咽拭子高［6］。在操作前应向患儿及家长做好解释工作。采集鼻咽拭子时，应先清除鼻腔前端的分泌物，将拭子由鼻腔插入，沿鼻腔壁伸入鼻咽部直至感到一定阻力时，转动数次，然后将拭子取出。采集时，拭子应朝向耳方向而不是头顶方向。采集口咽拭子时，患儿先用生理盐水漱口，对于漱口不合格者，可嘱患儿少量饮水吐出或咽下；嘱患儿张口发“啊”音，以暴露口咽部，必要时用压舌板压住患儿舌部，拭子越过舌根到咽后壁或悬雍垂的后侧，适度用力抹拭咽后壁和两侧扁桃体部位，并适当旋转以增加接触面积，注意避免触及舌部。咽拭子应置入VTM或其他缓冲液中［7］。

鼻（口）咽拭子条均有商品化产品。植绒拭子可吸附更多的生物样本并可达到较高的释放率。植绒材料应该为聚酯纤维（daceron，又称涤纶）或聚酰胺纤维（nylon，又称尼龙），均不应含藻酸钙，尼龙纤维制成的植绒拭子能收集到更多的呼吸道上皮细胞，适于直接免疫荧光法（direct immunofluorescence assay，DFA）检测呼吸道病毒抗原［8-9］。而聚氨酯纤维（spandex，又称氨纶）相比尼龙和涤纶拭子更适合用于采集过程中较易出血的患儿。普通木柄的棉拭子可能含有对细胞培养有害的物质，且常不能采集到足够量的脱落细胞，不适用于鼻咽或口咽部分泌物的采集。

1.3.2　鼻咽吸取物　鼻咽吸取物较咽拭子有更高的阳性检出率［10］，可用于病毒核酸和病毒抗原检测。采集鼻咽吸取物时， 将无菌吸痰管与无菌收集器相连， 再将吸痰管送入患儿鼻咽部至产生抵抗， 稍回抽， 利用负压吸取鼻咽部分泌物1～2 mL至无菌收集器中。压力的调节以能吸出分泌物为宜，对婴幼儿压力一般不超过200 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）［11］。导管中的残余液体，可加入VTM 或者无菌生理盐水冲洗至收集器中。部分儿童可采集鼻咽洗液，利用连有注射器或真空管的导管，向鼻腔中注入无菌生理盐水灌洗，将灌洗液通过导管上的注射器或真空管转移至含有VTM 或生理盐水的无菌收集器中，适合于病毒核酸检测［12］。重症患儿采集鼻咽吸取物时要注意观察患儿的面色、呼吸、心率和血氧饱和度改变，若有异常反应须及时处理。

1.3.3　支气管肺泡灌洗液　患儿在静脉麻醉或气道局部麻醉后，导入支气管镜。病变局限者选择病变段，弥漫者选择右肺中叶或左肺舌叶。支气管镜顶端嵌顿在目标支气管段或亚段开口后，经操作孔道快速注入37℃或室温无菌生理盐水，每次5～20 mL，共3～4 次，用合适的负压进行抽吸，以压力不超过100 mmHg，回收率＞30 %为宜［13-14］。支气管镜操作的适应证、禁忌证和注意事项参照相关指南［14］。

1.3.4　痰液　适合于病毒核酸和病毒抗原检测。采集前准备无菌收集器和清水，并向患儿提供指导，用清水漱口2～3 次，再用力咳出深部痰液，将痰液咳入无菌收集器内，盖好并拧紧杯盖，尽快送检。也有报道采用诱导痰的方法获得标本检测呼吸道病毒［15］，但是在年幼儿常不能获得合格的痰液标本，因此常用鼻咽吸取物代替。

1.3.5　气管吸取物　有气管插管或气管切开等人工气道的患儿无法自行咳痰，可通过吸痰管从气道吸取标本。予患儿吸氧后，将无菌吸痰管连接到呼吸道标本收集器中，通过气管内插管或气切管将一次性无菌吸痰管推进呼吸道直至遇到阻力，将吸痰管抽回1～2 cm开始吸引［11］，留取标本在无菌收集器内及时送检。

1.4　血清标本　血液采集要遵循医疗规范，应尽可能采集急性期和至少间隔2周的恢复期血清，要注意防止标本溶血。

2    标本的转运

2.1　标本送检　因病毒活性会随着时间延长而降低，标本采集后应尽快送检。呼吸道标本应在室温下30 min内送检， 4℃环境下可在2～4 h内送检，来不及处理的标本4℃保存不应超过48 h［16］。准备做病毒培养的标本在运送过程中需要保存在VTM中，液体标本如支气管肺泡灌洗液一般不必使用VTM运送。但要注意的是，当需要对标本进行多种微生物检测时， 采集的标本中不宜加入VTM， 而需要分别采样或将标本分装至合适的运送培养基中。

2.2　标本储存　如果预计可能延迟24 h才能送检，标本应在-70℃条件下保存，但用于病毒分离的样本不推荐低温冷冻（≤-70℃）。同时标本应避免反复冻融。

3    实验室检测方法

3.1　呼吸道标本的检测方法

3.1.1　病毒分离培养　经典病毒分离培养方法有动物培养、 鸡胚培养和组织细胞培养。组织细胞培养因操作相对简单且成本较低而被广泛采用。应在生物安全二级（bio-safety level-2， BSL-2）条件下进行， 当临床样本可能来自疑似高致病性病毒感染（如禽流感病毒）患儿时， 病毒分离培养操作应在BSL-3或生物安全条件更高的实验室中进行。

呼吸道病毒分离培养是病毒检测的金标准，但培养周期较长，检测环节较多，操作不易标准化，对人员技术要求较高，不适合临床开展。

3.1.2　病毒抗原检测　基本原理为病毒抗原和特异性抗体相互结合，快速检测临床标本中的病毒抗原。根据抗体标记物的不同，有直接或间接免疫荧光法、放射免疫法、酶联免疫法、胶体金免疫分析、免疫层析法等。直接免疫荧光法是通过荧光素直接标记特异性抗体来检测相应的病原体。因此，不同的病毒检测需要制备相应的荧光抗体，较间接免疫荧光法的成本高，但减少了二抗可能导致的非特异性反应，从而提高了特异性。目前国内常用的直接免疫荧光法检测试剂盒可以检测呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、2、3等7项病毒。临床采集的鼻咽和气管吸取物、BALF或痰液均可用于免疫荧光法检测呼吸道病毒抗原，而咽拭子获取的细胞数较少，不适用于免疫荧光法检测。胶体金免疫分析和免疫层析法检测呼吸道病毒抗原操作简单、快速，不需要特殊设备，可实现床旁检测（point-of-care testing，POCT）［17-18］。

呼吸道病毒抗原检测特异度较好，阳性提示活动性病毒感染，但灵敏度较低，需要采集到足够量的呼吸道上皮细胞，因此阴性不能排除相关的病毒感染，此外污染的黏液可产生非特异性荧光，需要经验丰富的实验技术人员进行判断。

3.1.3　核酸检测　随着分子生物学技术的不断改进，病毒核酸检测方法迅猛发展，由于其快速、简便、高通量、高敏感度及高特异度的优势，成为诊断呼吸道病毒感染的主要方法［19-20］。从呼吸道标本中提取病毒核酸，利用病毒基因特异的寡核苷酸作为引物，加入热稳定的核酸聚合酶，在合适温度下对病毒的特异基因片段进行重复扩增，采用多种不同的方法检测病毒特异性的扩增产物。临床采集到的咽拭子、吸取物、BALF或痰液均可用于检测。

最常用的核酸检测方法是聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）， 包括单目标终点法、 巢式PCR、 实时PCR 和定量PCR 等， 其中定量PCR 不仅能检测样本中的特定DNA或RNA，而且还能量化， 可以反映呼吸道病毒的复制水平， 动态监测有助于判断疗效［21］。多重PCR 法的出现提高了诊断效率， 该方法不易交叉污染， 试验操作简便， 容易标准化， 已有多种商品化试剂盒， 可同时快速检测临床标本中多种常见的呼吸道病毒核酸［22-23］。各种PCR检测方法的优缺点比较见表1［24］。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种全新的核酸扩增方法，在灵敏度、特异度和检测范围等指标上能媲美PCR技术，可以不依赖专门的仪器设备实现现场快速检测，检测成本亦低于荧光定量PCR［25-26］。其他核酸检测方法还包括依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）、基因芯片技术（microarray）等。目前核酸检测技术已可实现POCT，1 h左右可获得多种常见呼吸道病毒的核酸检测结果，为临床呼吸道病毒感染的诊治提供快速诊断。

相对于常规核酸检测，Sanger测序技术、焦磷酸测序技术和二代测序技术等［27］可得到病原体的基因序列，最快可在5～6 h获得病毒的整个基因组序列［20］，从而为病毒感染的诊断提供更多的信息。二代测序技术不但在高通量方面表现出优势，而且在发现新病原方面也有突破性进展［27］，但目前二代测序的结果还需要验证，不能直接用于临床诊断，且费用较高，要广泛应用尚待时日。

核酸检测技术特异性强、敏感、快速，可用于早期诊断，但由于潜在的残留污染和交叉污染，存在核酸检测假阳性的可能，且部分病毒核酸检测阳性（如鼻病毒、肠道病毒和冠状病毒等）不能确定是否为现症感染，要结合流行病学、临床特征及血清抗体检测等综合判断［28］。

3.1.4　病毒直接检测　通过电子显微镜可直接观察到呼吸道标本中病毒的典型特征形态，但要求标本中有大量的病毒（108～109/L）才能检测到，并且需要有经验的技术人员和昂贵的电子显微镜设备，操作复杂，技术要求高，不适宜用于呼吸道病毒感染的临床诊断。

3.2　血清抗体检测　病毒感染的血清学检测方法包括补体结合试验、血凝抑制试验、中和试验、免疫黏附血凝试验等，机体对病毒入侵作出应答或通过免疫反应可检测到抗体，其中IgM有短暂出现的特点，它的出现表明感染发生于当前或近期，IgG在一段时间内显著升高也可作为现症感染的依据。在初次感染中，IgM在症状出现的几天内出现，7～10 d达到高峰，30 d后迅速降低，部分患者2～3个月后仍可检测阳性。病毒自然感染或人工免疫后，IgG在IgM产生后几日内出现，到达比IgM更高的水平，并逐渐下降为一个略低的水平持续数年甚至终生。当再次感染时，IgG发生记忆应答，IgM则应答或不应答，IgA、IgD和IgE的预测价值没有IgM和IgG高。通常单份血清标本IgM阳性提示有急性感染可能，血清抗体水平显著升高或降低（4倍或者更高）临床价值更大［29］。

已有商品化的酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒可检测血清中呼吸道病毒的抗体水平。由于呼吸道病毒感染的潜伏期较短（1～3 d），而血清学阳转需要过程，婴幼儿可因免疫反应较弱而出现假阴性；另外，还存在IgM检测低敏感性以及免疫功能不全者缺乏抗体应答等因素，因此血清抗体检测对儿童呼吸道病毒早期诊断的价值有限。

各种检测方法特点比较见表2。

4    生物安全

4.1　采集标本的防护　采集标本时，医护人员应注意穿戴个人防护装备，以防止采集过程中通过接触、空气等造成医护人员感染。

4.2　实验室防护　通常大部分呼吸道病毒可在生物安全二级实验室（BSL-2）进行处理，而某些特定病毒（如SARS冠状病毒）须在生物安全三级实验室（BSL-3）进行处理。对于怀疑高致病性病毒可能时，实验室应提供标本采集和运送的操作指南。从事高致病性微生物的临床检测和研究人员，应接受相关资质机构的标准生物安全培训，获得资质认定后才能上岗。 

4.3　实验室间标本运送　应按照国家有关生物安全标准标识、包装标本。运送过程应符合生物安全规范的要求，运送者应接受培训，经考核合格后方可上岗，运送期间应配备必要的保护措施。对于高致病性病原微生物标本的转运应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》中的相关要求进行。