非洲猪瘟检测大事记

    非洲猪瘟是个百年老病，来到中国后发生了前所未有的“变异 ”，这种变异使得原有的百年检测经验需要及时更新，因此我国2020.12.14发布了GB/T 18648-2020 非洲猪瘟诊断技术；世界动物卫生组织OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 于2021.5对非洲猪瘟一节进行了更新，2021年3月和11月我国官方权威机构相继发布了《养猪场非洲猪瘟变异株监测技术指南》和《养殖场非洲猪瘟病毒变异株防控技术指南》，原博士带你抽丝剥茧梳理一下非洲猪瘟的检测大事记。

一、前言

    非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的，以全身出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征的一种猪的急性、热性、高度传染性疾病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告的动物疫病，我国农业部2008年新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将其列为一类动物疫病。

    非洲猪瘟病毒（ ASFV）是二十面体对称的、具有囊膜双链 DNA 病毒，病毒基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，长度在170~190 kb之间。分类上属非洲猪瘟科 （Asfarviridae ），非洲猪瘟病毒属（ Asfivirus ）成员 ，而且是其中的唯一成员。ASFV对外界的抵抗力强，有较强的酸碱耐受性。ASFV可以在猪骨髓细胞、单核细胞等原代细胞和猪、猴以及其他动物的肾传代细胞上培养增殖，并产生红细胞吸附现象。根据病毒对家猪致病性的不同，ASFV可以分为强毒力毒株、中等毒力毒株以及低毒力毒株三种类型，而根据B646L基因序列的差异又可将病毒分为24个的基因型，但病毒毒力的类型和病毒基因组分型并无必然的联系。

二、非洲猪瘟检测大事记

1.非洲猪瘟发生

2018 年8 月1 日，我国在沈阳发现首例非洲猪瘟疫情，经鉴定为非洲猪瘟基因II 型，与目前在俄罗斯和东欧流行的格鲁吉亚毒株（Georgia 2007）同属于一个进化分支。

2.非洲猪瘟核酸检测试剂评价

    2019年初中国动物疫病预防控制疫控中心受农业农村部委托开展了2次非洲猪瘟试剂盒的评价工作，评价为临时性的，目前非洲猪瘟核酸检测试剂都必须获得新兽药证书。

3.生物制品的非洲猪瘟检测

    2019年5月，为确保兽用生物制品质量安全，防止非洲猪瘟病毒污染相关制品，中华人民共和国农业农村部发布第172号公告 ，要求自2019年5月5日起，各兽用生物制品生产企业应对（一）猪用及采用猪源原辅材料制备的生物制品成品及半成品；（二）猪源毒种；（三）猪源细胞及相关制品生产用细胞；（四）其他猪源原辅材料（如组织、血清、胰酶等）等全面开展非洲猪瘟病毒核酸检测。检测方法按照《猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法》

4.非洲猪瘟国家标准物质证书获批

    2019年12月中国动物疫病预防控制中心和中国动物卫生与流行病学中心同时获得2项非洲猪瘟标准物质。

这是非洲猪瘟标准物质评审当天我发的朋友圈，想听故事的人可以来找我。

5.非洲猪瘟7基因缺失弱毒疫苗

    2020年5月，哈尔滨兽医研究所发表其研发的非洲猪瘟7基因缺失活疫苗的文章。疫苗缺失了MGF、CD2v、9GL、DP148r和UK基因等基因，同时引入了eGFP和mCherry荧光标签。

6.非洲猪瘟变异株

    2021年2月，军事医学科学院、哈尔滨兽医研究所和中国动物卫生与流行病学中心相继发表文章，揭示了我国临床中存在自然变异弱毒株的现实。

7.非洲猪瘟变异株技术指南

    7.1 2021年3月国家非洲猪瘟参考实验室发布了《养猪场非洲猪瘟变异株监测技术指南》

（一）病原检测方法

　　采用非洲猪瘟病毒（P72/CD2v/MGF）三重荧光PCR方法检测核酸，详见“农办牧〔2020〕39号”附件《非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范》。必要时可测序鉴别。

    这个技术规范中并没有公开引物探针序列，而是“P72、CD2v、MGF360-505R基因扩增引物和探针由国家非洲猪瘟参考实验室设计并提供”。

（二）抗体检测方法

    采用间接ELISA、阻断ELISA等方法检测抗体水平，详见《非洲猪瘟诊断技术》（GB/T 18648）。

7.2 2021年11月，中国动物疫病预防控制中心联合非洲猪瘟区域实验室（广州）发布《养殖场非洲猪瘟病毒变异株防控技术指南》

    病原学检测方法除了建议使用P72/CD2v/MGF三重荧光，还建议使用P72/EGFP/mCherry三重荧光（EGFP和mCherry均为荧光蛋白标签）,这个技术规范中也没有公开引物探针序列，而是放了个专利CN112646934B。

几个国家级单位发布的技术规范都不公开方法，格局是不是有点小。

8.非洲猪瘟抗体检测试剂评价

    2021年7月，中国动物疫病预防控制疫控中心公布了非洲猪瘟病毒抗体检测试名单。一共33个非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中有3种类型的ELISA，分别是间接ELISA（17个），阻断ELISA（12个）和夹心ELISA（4个）。

9.基因I型非洲猪瘟病毒

    中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家非洲猪瘟专业实验室首次报道，基因I型非洲猪瘟病毒已入侵我国田间猪群，并可引起慢性感染发病。科研人员在流行病学监测及病原学研究过程中，从山东和河南两地猪场临床发病猪样品分离出两株基因 I 型非洲猪瘟病毒SD/DY-I/21和HeN/ZZ-P1/21，两株病毒均无血吸附活性。

    全基因组进化分析表明，这两株病毒与上世纪葡萄牙分离的基因I型低致死毒株NH/P68 和 OURT88/3 高度相似。NH/P68 于1968年从葡萄牙的一头具有慢性症状的家猪中分离， OURT88/3 于1988年从葡萄牙猪场的软蜱中分离。葡萄牙和西班牙已于九十年代彻底根除非洲猪瘟，目前NH/P68和OURT88/3仅保存于国外少数几个实验室，限于严格生物安全条件下开展相关基础与应用研究。此类病毒通过何种途径侵入我国，有待进一步了解。

10.非洲猪瘟检测的生物安全

    非洲猪瘟是国家一类动物疫病，一切实验活动应严格在符合条件的实验室开展，这本应是行业的基本共识，如今发生的很多事情的本质就是生物安全有没有做好。

10.1《农业农村部办公厅关于加强非洲猪瘟病毒相关实验活动生物安全监管工作的通知》中要求：

“从事非洲猪瘟病毒相关实验活动的实验室应当具备相应生物安全防护水平。从事非洲猪瘟病毒分离和鉴定、活病毒培养等实验活动的，应当在生物安全三级、四级实验室进行。从事动物接种（感染）试验等实验活动的，应当在具备中型及以上实验动物条件的生物安全三级、四级实验室进行。

各省级畜牧兽医主管部门要对辖区内从事非洲猪瘟检测的实验室全面开展生物安全检查。主要检查内容包括：一是开展检测活动的实验室是否经省级畜牧兽医主管部门批准，具备相应设施设备和专业技术人员，管理体系健全，近三年内未发生任何生物安全事故，具有生物安全二级或以上的实验室生物安全防护水平。二是实验室活动是否严格遵守实验室生物安全操作规范。是否按要求做好样品检测前的处理和灭活，检测结束后废弃物的消毒和无害化处理，相关物品和设备设施的清洗消毒，以及剩余样品的销毁等无害化处理。三是实验室检测结果是否按规定及时上报。对于发现的疑似阳性结果，是否立即报告所在地省级动物疫病预防控制机构，并反馈送样单位。  ”

10.2  SN/T 5335-2020 非洲猪瘟检测实验室生物安全操作技术规范

    “从事高致病性病原微生物分离和动物体上相关实验活动的，应在生物安全三级以上实验室进行。

     开展非洲猪瘟病毒核酸和抗体检测的实验室，其设施设备配置应符合GB 19489 中生物安全二级（BSL-2）及以上实验室的要求。样品灭活前的实验活动应在生物安全柜中操作，废弃物及检测完样品应经高压蒸汽等消毒处理。

    开展非洲猪瘟病毒核酸和抗体检测的实验室，其所从事的检测实验活动种类应达到相应级别的生物安全实验室防护要求，并取得主管部门的批准。未取得授权或检测资质的实验室不应开展非洲猪瘟检测。”

三、检测方法汇总

1.国内外ASFV检测标准方法

2.OIE关于非洲猪瘟的检测方法

2021.5月更新的手册我发现多了一段文字：

“Animals that have recovered from either acute, subacute or chronic infections may potentially become persistently infected, acting as virus carriers. The biological basis for the persistence of ASFV is still not well understood, nor it is clear what role persistence plays in the epidemiology of the disease.”

“动物可从急性、亚急性或慢性感染中恢复，作为病毒携带者，成为潜在的持续感染者。ASFV持续感染的生物学基础仍未被充分了解，也不清楚持续感染在疾病的流行病学中扮演的角色。”

    我读这段新增的文字感受到一股无奈和绝望，你可以想象一下作为存在了100多年的病毒，很多研究了一辈子非洲猪瘟的研究者发现自己还有这么多问题不清楚，中国功不可没。

OIE非洲猪瘟的检测技术

3.非洲猪瘟检测的确诊方法

3.1病原检测的确诊方法

病原确诊的金标准有两个：一个是分离到病毒，另一个是基因测序获得特征性的病毒序列。除此之外使用数字PCR方法获得病毒的绝对拷贝数也是一种方式。

ASFV数字PCR检测结果

（北京中科基因技术股份有限公司提供）

3.2血清学检测的确诊方法

a.间接荧光抗体试验IFAT：国标和OIE都认可的确诊试验。细胞固定后通过耦联的荧光素进行检测。阳性样品在感染细胞的胞浆中出现特异性荧光。IFAT是一种快速、高度敏感和特异的 ASF 抗体检测技术，适用于血清、血浆或组织分泌物中抗体的检测。IFAT比ELISA具有更高的敏感性，结果通过形态和细胞中染色位置判定结果，可以排除非特异抗体对结果的干扰。

ASFV IFAT结果

（北京中科基因技术股份有限公司提供）

b.间接免疫氧化物酶试验 IPT：OIE认可的确诊试验。细胞固定后通过耦联的过氧化物酶进行检测。IPT 是具有高度的敏感性和特异性的快速检测技术，适用于从血清、血浆或组织渗出液中检测ASF 抗体。

c.免疫印迹试验 IB：OIE认可但存在局限的确诊试验。IB 技术中使用了覆盖有病毒抗原的纸条，首先是抗原溶解、电泳分离、以及转移到薄膜上（通常是硝化纤维素膜），之后与特异性一抗反应，再与标记二抗作用后，产生可直接观察的阳性反应条带。接种其他病毒疫苗的动物血清，可能会产生非特异性反应。

四、非洲猪瘟的检测策略

1.核酸检测

    对于养殖场和检测实验室来说，检测到ASFV是关键，P72仍然是最重要的ASFV通检靶标，至于P72/CD2v/MGF三重荧光或者P72/EGFP/mCherry，个人觉得已经不是很重要了，因为不论感染哪种“变异株”，感染猪都会持续带毒和排毒。研究机构除外。

    对于ASFV基因I型需要关注，需要验证试剂盒是否会对基因I型漏检。

2.抗体检测

    目前只进行核酸检测漏检的可能性比较大，还需要定期对猪群进行抗体检测。ASFV ELISA抗体检测中，血清处理或保存不当（储存或运输不当），如溶血样品可能会产生假阳性结果。建议准备2种不同原理的ELISA试剂盒，一种用于初筛（间接ELISA或阻断ELISA），另一种用于确诊（阻断ELISA或双抗原夹心ELISA）。通过 ELISA 检测的所有阳性和可疑样品最终确诊还需要使用IFA。

    写这篇文字时我百感交集，所有事情都历历在目。我们都是这段历史的见证者与参与者。行业中的每个人都到了该反思的时刻，否则个人就无法成长，行业也没有未来。一切诸果，皆从因起，一切诸报，皆从业起。