检验新秀 | MRD：微小残留病灶

⑴ MRD是一个术语，在治疗患有血液肿瘤（例如白血病，淋巴瘤或多发性骨髓瘤）的患者时，医生通常会使用此术语；

⑵ MRD（Minimal Residual Disease），即微小残留病灶，是指癌症治疗后残留在体内的少量癌细胞（对治疗无反应或耐药的癌细胞）。残留的癌细胞数量可能很少，不会引起任何体征或症状（但它们有可能导致癌症复发），甚至无法通过传统方法检测到，例如在显微镜下观察细胞和/或追踪血液中的异常血清蛋白标志物（肿瘤标志物）；注意的是，现在NCCN指南和欧洲专家共识中MRD有时也指Measurable Residual Disease，即可测量残留病灶；

⑶ MRD是一种生物标志物，阳性结果意味着癌症治疗后仍可检测到残留（剩余）病灶（发现癌细胞，癌症治疗后残留的癌细胞会变得活跃并开始繁殖，导致疾病复发），阴性结果表示癌症治疗后未检测到残留（剩余）病灶（未发现癌细胞，对血癌患者来说是好事，研究表明MRD阴性与某些血癌更长的缓解期和更长的生存率有关）；

⑷ 医生可使用MRD来衡量治疗的有效性，并预测哪些患者有复发的风险：可帮助医生动态监测和确认疾病的缓解情况，早期发现复发迹象，并尽早开始治疗；可告诉医生初始治疗效果如何，如果标准治疗方案效果不佳，医生会更改治疗方案，以更有效地获得疾病缓解；

⑸ 何时检测MRD？何时检测MRD有不同的标准，应根据患者疾病的特定因素来决定。患者可以在联合治疗的最后一个周期后进行检测，可以在骨髓移植后进行检测，可以在治疗期间进行检测确定缓解深度，可以在一年的维持治疗后进行检测，也可以在治疗结束后定期进行检测或在其他特定时间进行检测；

⑹ MRD检测样本？为了检测MRD，医生通常使用血液样本（静脉）或骨髓样本（抽吸）；

⑺ MRD检测技术？MRD检测应使用高灵敏度的检测方法，如此才能更有效地在众多健康细胞中发现少量癌细胞。最广泛使用的检测方法是：1）流式细胞术（FC，通过检测细胞表面是否存在某些蛋白质标记物来评估某个细胞的技术；为了得到可靠的结果，需要新鲜的骨髓抽吸样本，然后使用特殊的抗体处理，这种抗体只粘附在带有特定蛋白的细胞上，该检测方法可以在10万个骨髓细胞中发现一个癌细胞，检测结果一天内可以得到）；2）聚合酶链式反应（PCR，可以根据其特有的遗传变异，如突变或染色体变异识别恶性肿瘤细胞；PCR本质上是增加或放大少量的特定DNA或RNA片段，使它们更容易检测和计数，因此即使癌细胞数量非常少，也能通过PCR检测出基因异常，该检测方法可以在骨髓或血液样本的10万-100万个正常细胞中识别出一个癌细胞，检测结果可能需要几天或几周）；3）二代测序（NGS，可以快速检测DNA或RNA片段；NGS可以检测从骨髓抽吸样本中提取的DNA突变和其他遗传变异，该检测方法可以在100万个骨髓细胞中检测出一个癌细胞，检测结果一周内可以得到；2018年美国FDA“批准”了一款名为clonoSEQ的检测，基于NGS方法，检测急性淋巴细胞白血病（ALL）和骨髓瘤中的MRD（特异性基因组重排））； 

⑻ 如上所述，MRD是血液肿瘤临床标准实践的一部分。在实体肿瘤（如乳腺癌，肺癌，结直肠癌，前列腺癌等）中使用MRD较新，但最近几年的一些针对实体肿瘤的MRD研究，使MRD可能成为临床的标准治疗方法；

⑼ 近年来，在实体肿瘤领域，基于ctDNA指导的MRD（微小/可测量残留病灶）评估，优于传统的临床或影像学方法鉴定出有MRD的患者，并在预测疾病复发风险等方面具有较高的灵敏度和特异性。注意的是，实体肿瘤中的MRD有时也指Molecular Residual Disease，即分子残留病灶；

⑽ 早期报道的关于手术后肿瘤释放到血液中的ctDNA水平与治疗结果的相关性显示，ctDNA高水平的患者与低水平的患者相比表现更差 ，对此的解释是，高水平的ctDNA负荷表明存在肿瘤，要么保留在手术部位，要么以远处转移的形式出现，这些患者会很快复发；

⑾ 基于ctDNA指导的实体瘤MRD可行性评估显示，在鼻咽癌，结肠癌，直肠癌，乳腺癌，胰腺癌，肺癌等多种实体肿瘤中是可行的，在最终治疗（手术或放疗）后第10天至16周检测患者血液中的ctDNA，MRD阳性患者的无疾病生存期（DFS）显著降低，复发风险率显著升高（HR=3.1–43.4）；

⑿ 基于ctDNA指导的实体瘤MRD可行性评估显示，MRD检测优于传统的临床或影像学方法鉴定出有疾病复发的患者，在不同的癌种中，具体的提前时间为，鼻咽癌6个月，乳腺癌7.9-11个月，胰腺癌6.5个月，肺癌70天-5.2个月，结肠癌167天-10个月；

⒀ 实体肿瘤MRD检测的难度较大，主要原因有两个：1）每个患者的实体肿瘤类型不一样，是自身所特有的，并且每个患者个体中仅携带非常少量（如果有的话）相同的基因突变，这意味着panel设计的难度大于血液肿瘤，除了NGS大panel，目前能做的便是开发个性化的MRD检测panel；2）实体肿瘤早期释放到外周血中的ctDNA含量一般非常的少，低于1%，这意味着实体肿瘤ctDNA的检测需要比白血病MRD检测（大部分都是肿瘤DNA）拥有更高的检测灵敏度；

⒁ 多家肿瘤基因检测公司正在开发MRD检测方法：Natera，ArcherDx，Genosity，  Inivata等，他们都使用类似的工作流程，首先通常采用WES检测实体肿瘤患者中的体细胞变异（仅在肿瘤中发现的突变，通过血液比对），然后去除克隆性造血突变（仅在血液中发现的突变），最终将其纳入MRD检测；大约10-50个变异（通常是在大多数癌细胞中发现的截短突变）被用于MRD分析的开发，然后设计引物/探针，这些引物/探针可用于PCR检测或NGS杂交捕获检测，通常在术后约四周进行MRD试验；

⒂ 实体肿瘤MRD检测的三个关键要素，1）必须高灵敏度；2）必须快速且易于使用；3）必须具有成本效益（此处并非指便宜）；

⒃ 上面三个关键要素，最重要的是1）和2），这也就意味着在开发非个性化MRD检测panel（第2点）的同时必须进一步提高其检测灵敏度（第1点），怎么破？对，就是表观遗传学，ctDNA甲基化！它可以在不改变肿瘤基因序列的情况下控制基因的表达，它所关注的不是肿瘤基因组中的基因突变，这些表观基因组“标记”在不同患者之间甚至在不同癌症之间更相似，表观遗传学变化比肿瘤突变多得多，使其成为新的MRD检测理想候选者；

⒄ GRAIL，癌症领域的早筛圣杯，最近被Illumina收购了，但它在MRD这块其实早有布局，其转化癌症检测的PPT中第11页就重点介绍了他们未来几年将在MRD方面所做的工作，GRAIL的癌症早筛技术，现已锁定在了ctDNA甲基化上，MRD检测亦是必然；

⒅ 国内MRD技术方法做的比较好的，目前看好的是燃石（实话实说，还是需要向其看齐），其MRD检测方法于去年10月公开亮相于首届国际液体活检大会，基于DNA甲基化和突变两个维度的微小残留病灶（MRD）检测方法可以识别更多的高危患者，并预测非小细胞肺癌（NSCLC）的无病生存期（DFS）；

⒆ 在实体肿瘤中使用MRD仍处于起步阶段，但是对患者的影响可能会非常大，以至于科研界和生物界，甚至于商界正在大力投资MRD领域，实体肿瘤MRD检测可能会取得快速的发展；

⒇ 下一个十年，MRD的十年？

参考资料：

1.Minimal Residual Disease (MRD). (n.d.). Minimal Residual Disease (MRD). Leukemia & Lymphoma Society.

2.https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-authorizes-first-next-generation-sequencing-based-test-detect-very-low-levels-remaining-cancer

3.Schuurhuis Gerrit J,Heuser Michael,Freeman Sylvie et al. Minimal/measurable residual disease in AML: a consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party.[J] .Blood, 2018, 131: 1275-1291.

4.Coakley Maria,Garcia-Murillas Isaac,Turner Nicholas C,Molecular Residual Disease and Adjuvant Trial Design in Solid Tumors.[J] .Clin Cancer Res, 2019, 25: 6026-6034.

5.Shannon chuai，ctDNA Methylation & Mutation — A Two-Dimensional MRD Method Identifies More At-risk Patients and Predicts DFS in NSCLC.