《新冠肺炎实验室检测技术指南》的演化解析（二）样本采集 ...

致敬所有的医护和检测行业的工作者，谢谢你们守护广州！祝所有广州的朋友身体安康，尽快扫除疫情！

    《新冠肺炎实验室检测技术指南》的演化解析（一）介绍了该系列指南的演化过程。《新型冠状病毒肺炎防控方案（第八版）》中的附件10  新冠病毒样本采集和检测技术指南（简称指南）成了这一系列指南的集大成着。既从前七个指南演变而来，又较前几个指南发生了质的变化，成为了目前一系列检测标准的合集，非常值得认真学习。未来便于区分，引用原文使用蓝色字体。

    一、标本采集

    1.平行检测

    “（三）标本采集基本要求。2.无症状感染者、入境人员、密切接触者在隔离观察期间应采集鼻咽拭子进行核酸检测，解除隔离时应同时采集 2 份鼻咽拭子样本，分别使用不同核酸检测试剂检测，2 次检测原则上由不同检测机构开展。”

    首次引入了使用不同试剂不同检测机构平行检测的要求，这样能保证结果的准确性，但是如果碰上弱阳性样品，两个试剂或机构结果不一致时，有一个检出阳性就判为阳性还是两个都是阳性才能判为阳性呢？  参见如何解读“薛定谔的弱阳性”样品

    2.病毒灭活剂

       “（三）标本采集基本要求。4.人群筛查应根据核酸提取、检测所用试剂的要求确定采样管，可选择含病毒灭活剂（胍盐或表面活性剂等）的采样管。用于病毒分离的标本应放置于不含有病毒灭活剂的采样管。”

     病毒灭活剂的成分有很多种，这里明确了病毒灭活剂（胍盐或表面活性剂等）说明这类灭活剂经过了临床验证，灭活效果是可靠的。

    3.物体表面标本

    “（四）采集标本种类。7.物体表面标本：包括进口冷链食品或进口货物的内外包装表面，以及运输储藏工具等可能被污染的部位进行涂抹采集的标本。

    （四）标本采集和处理。(指南里标号就重了)。11.物体表面标本：参考《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T776—2021）推荐的方法，采样拭子充分浸润病毒保存液后在表面重复涂抹，将拭子放回 采样管浸润，取出后再次涂抹采样，重复3次以上。对表面较大的物体进行多点分布式采样。”

    随着进口冷链食品中不断检测出新冠病毒阳性，环境样品也纳入了检测的范围。在食品外包装是否能传播新冠的问题上目前仍然存在着争论，但是我认为只要能检测到病毒的核酸就不能排除病毒感染的风险。参见绝对不能忽视的食品中新冠检测阳性

《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T776—2021）引用了World Health Organization (2020) Surface sampling of coronavirus disease (COVID-19）的文件，在这个文件里对表面采样的描述有“Environmental samples need to be taken using a swab with a synthetic tip and a plastic shaft。. Wet the swab ，When applying pressure with the wet swab onto the surface, move in at least two different directions while rotating the swab stick. Avoid letting the swab dry completely. The recommended swab surface area is 25cm2. To increase the positive predictive value of the environmental sampling process, each sampling area may require multiple swabs.”

采样拭子采用合成纤维头和塑料杆的材质，先湿润拭子，在表面上至少2个方向重复采样，每个拭子的推荐面积是25cm2，可以增加拭子的数量。

采样示意图

拭子湿润后，在水平方向做S形涂抹，覆盖整个表面。

旋转拭子，在垂直方向做S形涂抹，覆盖整个表面。

旋转拭子，在对角线方向做S形涂抹，覆盖整个表面。

   4.污水标本

    “（四）采集标本种类。8.污水标本：根据海运口岸大型进口冷冻物品加工处理 场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处、污水流向的下游或与市政管网的连接处等2～3处点位 进行采样。

    （四）标本采集和处理。(官方文件标号重了)。12.污水标本：参考《农贸（集贸）市场新型冠状病毒 环境监测技术规范》（WS/T776—2021）推荐的方法，采集污水的拭子样本时，用拭子浸入吸附污水，将拭子放回采样管 浸润，取出后再次浸入污水，重复3次以上，对每个污水采 样位置应进行多点分布式采样。采集污水的水体样本时，用 聚乙烯塑料瓶收集1L～1.5L污水，大于1.5L体积的污水采集，可以使用聚乙烯塑料桶或现场水样专用富集设备。污水水体样本采集前，先充分混合均匀后取样；如果污水难以充 分混合，出现分层现象时，可按各层水量的比例分层取样。”

    《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T776—2021）中关于污水水样前期处理：“参考 WHO 的方法，使用离心技术去除污水中杂质。先打开低温离心机，待温度降至 4 ℃左右，建议 4654 g 离心力离心 30 min，取全部上清。再使用膜吸附技术或超滤技术（超滤管分子量 10 kDa～100 kDa）进行上清液的浓缩，浓缩后可获得 0.5 mL～2 mL 体积。”

        2020年8月，世界卫生组织WHO发布 “针对严重急性呼吸综合征冠状病毒的环境监测现状” 科学简报。许多地方已经出现了在未经处理的废水和/或污泥中检测到SARS-CoV-2的非传染性RNA片段的报道。例如意大利、西班牙 、澳大利亚 、荷兰 、美国和法国等 。病毒核酸可以在COVID-19病例确诊前提前4至7天发出预警。我国学者zhou也在武汉的医院医疗废水中检测到了新冠病毒。

    多项研究表明，在通过基于临床症状的监测系统发现COVID-19病例的前几天，环境样本中SARS-CoV-2 RNA的检出也会增加。因此，有可能利用环境监测进行早期预警，特别是在已经控制传播并正在放松公共卫生和社会措施的国家，或在出现季节性流行时，对聚集性疫情或暴发进行早期预警。  

    4.5动物样本和和气溶胶样本

    这部分内容指南中并没有提及，但是《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T776—2021）包含了这两部分内容。

    我们常规的检测对象都是人和动物，在One World, One Health理念下应该把目光转向环境，通过人居住的环境、动物养殖环境、动物的运输和交易环节的环境监测上。包括空气、污水、土壤和污染物等。

详见运用One Health理念重新思考病原检测

    4.5.1动物样本

    “用采样拭子采集其体表拭子、口咽拭子和肛拭子，也可以采集其排泄物或分泌物样本，并在记录单上进行相应记录。对于已经处理过的动物，分别用拭子采集其体表和体腔拭子样本，要求用病毒采样管中的病毒保存液充分浸润拭子后，对样本的表面重复涂抹、并将拭子放回采样管进行浸润，取出后再次涂抹采样，重复 3 次以上。对于体型较大的动物体表，进行多点分布式采样。”

    动物的种类繁多有家畜家禽、野生动物、实验动物、伴侣动物已经经济动物等等，这部分内容远远不够，还需要相关部门专门出台细则。

    4.5.2气溶胶样本

    “样品采集应符合 HJ/T 167、HJ/T 194 的规定。采样点的设置应符合 HJ/T 167、 HJ 664 的规定。采样前应根据采样任务和计划确定采样器类型、配件、辅助器材及其相应数量。根据不同类型空气采样器具体要求进行样本采集。采样器一般固定于支架上或置于平稳的表面上，采样高度应根 据具体情境和需求进行调整，一般情况下采样器进气口距离地面高度建议为 1.2 m～1.5 m。调整采样器流量至设定范围并记录采样开始时间，确保采样器运行正常且气密性良好。采样过程中应避免采样器 周围有人为因素的气流干扰。采样时间应根据实际环境中病毒的浓度水平进行调整。一般情况下病毒气溶胶的采样时间建议为 15 min～30 min。采样结束时，应记录采样结束时间、采样器流量、实时温度、气压和采样点等信息”

    我国学者zhou使用数字PCR的方法在医院的走廊、ICU病房和病床附近的空气中都检测到了新冠病毒。

    对于人和动物通过呼吸道传播的病原，比如流感病毒和新冠病毒或者在封闭环境下的室内空气中的病原检测，气溶胶的采样检测都十分的必要。但是空气中的病原含量很低需要使用专用的空气病原微生物采集设备和高灵敏度数字PCR才能检测得到。

    5.物品和环境样本的采集检测的质控

    “物品和环境样本的采集检测，还需在采样前及采样过程中至少设一个现场空白样本及一个运输空白样本，以进行过程中的质量控制”

    这是第一次提出环境采样的质控，由于环境采样的特殊性，污染的概率更大。在WHO的原文是“In each sampling round, a set of control samples also need to be collected. The first set of control samples are handled in the same way as the environmental samples from the potentially contaminated area, including opening the package and removing the swab from the tube, but without sampling any surfaces. The second set of control samples remain sealed, but will be shipped, stored and tested with the surface samples, to exclude contamination later on.”

    在每一轮的环境采样中，需要设置2组对照样本：现场空白样本指的是在现场打开拭子和管子但是不进行表面采样，用于监控采样现场的样本是否被污染。运输空白样本则是密封的采样管，与样本一起运输，监控运输过程样本是否被污染。2组对照都需要与样本一同检测来排除采样现场和运输过程的污染。

    6.样本的包装

  “（五）标本包装。1.所有标本应当放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里，拧紧。容器外注明样本编号、种类、 姓名及采样日期。

2.将密闭后的标本装入密封袋，每袋限一份标本。

3.涉及外部标本运输的，应根据标本类型，按照A类或B 类感染性物质进行三层包装。”

   7.样本的保存

    “（六）标本保存。用于病毒分离和核酸检测的标本应当尽快进行检测，可在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存（如无-70℃保存条件，则 于-20℃冰箱暂存）。血清标本可在4℃存放3天，-20℃以下可长期保存。应当设立专库或专柜单独保存标本。”

    8.样本送检

    “（七）标本送检。标本采集后应当尽快送往实验室，标本采集后室温 （25℃）放置不宜超过4小时。如果需要长途运输，建议采用干冰等制冷方式进行保藏。标本运送期间应当避免反复冻融。”

    有兴趣的可以补充学习：检测人员必看的采样知识点，病毒采样拭子的评估试验初探

    下篇文章将会解析本指南中最重磅的部分“新冠病毒的实验室检测”，敬请期待......

[1]关于印发新型冠状病毒肺炎防控方案(第八版)的通知http://www.gov.cn/xinwen/2021-05/14/content_5606469.htm

[2]《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T776—2021）

[3]World Health Organization (2020) Surface sampling of coronavirus disease (COVID-19): a practical “how to” protocol for health care and public health professionals, 18 February 2020, version 1.1. 

[4]Zhou, JB., Kong, WH., Wang, S. et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in Medical Wastewater in Wuhan During the COVID-19 Outbreak. Virol. Sin. (2021).

[5]LianZhou.,MaoshengYao.,biangZhang.et al. Journal of Aerosol Science.Volume 152(2021).