《非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识》全文及专家精彩解读（中） ... ... ... ...

五、常用的NTM鉴定方法

以生化试验为主的分枝杆菌菌种鉴定技术虽然曾经是经典方法，但由于操作复杂、耗时而结果不准确，因此已不常使用，目前主要用于新菌种的确定。现阶段临床常用的鉴定方法依据鉴别能力分为两大类：仅能鉴别MTC和NTM的初步菌种鉴定方法；能够将NTM鉴别至种水平的菌种鉴定方法。本共识主要关注目前临床最常使用的鉴别技术。

(一)初步菌种鉴定方法

1．对硝基苯甲酸(PNB)选择性培养基法：在我国广泛开展。绝大多数的NTM菌种在含有500mg/L PNB的罗氏培养基上能够生长，而MTC却不能耐受。较多证据表明PNB选择性培养基法用于MTC与NTM的鉴别结果可靠。虽然有少量报道某些NTM不能耐受PNB的情况，但所涉及的菌种多数在临床并不多见，因此对PNB方法的总体可靠性影响有限。少量文献报道MTC存在耐受PNB的情况，但均缺乏后续的确认研究，可靠性尚待证实。

应用PNB选择性培养基法应注意以下情况：(1)对于待测菌株在PNB培养基上生长，最初判断为NTM的菌株经其他鉴定方法进一步确认为MTC的情况，需考虑PNB培养基在制备和应用过程中操作不当和混合感染等因素：建议将对照培养基和含PNB培养基上生长的菌落分别进行鉴定，如果对照培养基菌落为MTC，PNB培养基上生长的菌落鉴定为NTM，考虑为混合感染；如果2种菌落均鉴定为MTC，则考虑为操作失误所致。(2)MTC与NTM混合感染时可能会造成实验室鉴定结果的不一致，需要给予关注。

2．MPT64抗原检测法：MPT64抗原是MTC在液体培养基中生长时主要分泌的蛋白之一，NTM培养滤液中多不存在此分泌蛋白，由此可以进行初步菌种鉴定。已有多种相关商业检测试剂上市，多采用免疫层析法检测培养滤液中MPT4抗原是否存在，具有操作简单、用时短等优点。已获得的诊断效率数据显示，就初步鉴定MTB与NTM而言，此技术具有很高的敏感度(多数报道超过97%)和特异度(多数报道超过97%)。

应用M1G64抗原检测法时应注意以下情况：(1)本技术用于检测分枝杆菌在生长过程中是否分泌MPT64抗原，因此需要首先获得阳性培养物；(2)当MTC编码MPT64抗原的基凶发生突变时，会出现假阴性结果，这种情况的发生率多为0%～3%；(3)有些M. bovis BCG株(如巴斯德株、哥本哈根株等)缺乏分泌相应抗原的能力，检测呈阴性结果；(4)检测敏感度与MPT64抗原的分泌量有关，有些情况下获得阴性结果的标本延长培养时问后可获得阳性结果；(5)个别NTM菌种，如海分枝杆菌和浅黄分枝杆菌可产生微量MPT64抗原，因此检测呈弱阳性结果；(6)当MTC与NTM共同生长时，将报告阳性结果，因此无法反映NTM的存在。

3．核酸扩增试验：即通常所说的聚合酶链反应(PCR)技术。目前已经有多款用于结核病诊断的PCR试剂盒上市，其扩增的靶序列往往是MTC中特异性的DNA序列，如IS6110、MPT64、ESAT-6及CFP-10等。将PCR技术与涂片和培养结合可用于NTM的初步筛查。对于涂片阳性或是培养阳性的标本，平行的PCR扩增获得阳性结果提示样品中存在MTC菌，反之，当PCR为阴性结果时，应考虑存在NTM的可能，但需要进一步核实。

应用PCR技术结合涂片或培养筛查NTM时应注意以下情况：(1)多种因素可以影响PCR扩增效率，如DNA提取效率、扩增抑制物的存在等，导致假阴性结果；(2)扩增靶序列在少量MTC菌株中天然缺失，如少量MTC菌株IS6110序列的拷贝数为零，这种情况可能引起误判。

(二)菌种鉴定方法

虽然目前菌种鉴定水平已能够满足临床的主要需求，但持续提高菌种鉴定水平有利于进一步提高临床诊疗水平，如将脓肿分枝杆菌进一步划分后发现，与阿奇霉素相比脓肿分枝杆菌亚种更易于发生克拉霉素耐药，而马赛分枝杆菌对2种药物的耐药性无差别，由此可解释临床含克拉霉素的方案对马赛分枝杆菌感染患者的疗效优于对脓肿分枝杆菌亚种感染患者的现象。依据鉴定的原理，目前NTM菌种鉴定主要包括2大类方法：比较同源基因或序列差异的分子诊断技术和分析细菌菌体组成成分差异的鉴定技术。

1．分子诊断技术：(1)直接的同源基因或序列比较方法：通过分析同源DNA序列组成差异鉴定细菌至种水平，是目前菌种鉴定的“金标准”。可用于菌种鉴定的DNA序列既要求在不同的菌种间具有较高的序列保守性，实现应用通用引物对不同菌种目标序列的扩增，又要求不同菌种的同源序列具有一定水平的差异，以实现鉴别区分的目的。目前最常用的同源序列有16S RNA编码基因(16S DNA)、16S-23S rRNA基因间区(internal transcribed spacer，ITS)、RNA聚合酶的β-亚基(RNA polymerasesubunit，rpoB)和热休克蛋白65(hot shock protein65，hsp65)的编码基因，仅就鉴别能力来看，hsp65优于rpoB和ITS，而16S DNA的鉴别能力最低。应用单一的DNA同源序列进行菌种鉴定至少在以下几方面存在不足：①单一的DNA同源序列分辨力不足，一些亲缘关系相近的分枝杆菌无法被准确鉴别，如16S DNA在分枝杆菌属不同菌种间序列相似性为94.3%～100%，单靠这一序列无法准确区分具有临床价值的堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌和苏尔加分枝杆菌等。②由于针对每个单一序列的公用数据库都可能存在信息不全，或是由于公用数据库在上传DNA序列时缺乏质量控制等情况，有引起错误鉴定的可能。③一些新的菌种或亚种的鉴定往往是在联合应用了更多同源序列的情况下被发现，如联合16s DNA和ITS鉴定为脓肿分枝杆菌的菌群，在结合使用hsp65和rpoB基因后，进一步分为脓肿分枝杆菌亚种、M．bolletii亚种和马赛分枝杆菌。随着分子标识的增多，未来分枝杆菌菌种鉴定工作将更加细致。应用同源序列比较进行菌种鉴定的建议：①16S DNA鉴别能力虽然相对较低，但由于目前其相关数据库最为完整，因此推荐常规使用。②ITs、hsp65和rpoB基因鉴别能力相对较高，建议至少选择其中之一与16S DNA平行使用，以提高菌种鉴定的分辨能力。③在序列比较过程中对于种内序列差异较大的情况，应增加分子标识的检测数量，以期提高分辨率、发现新的种或亚种。(2)间接的同源基因或序列比较方法：目前已经商业化的试剂盒通过设计针对特定同源基因或序列(如16s DNA、ITS等)特定的单核苷酸多态性位点的探针，并将探针标记在固相的基质上(如纤维素膜、芯片等)，通过探针与待检测序列的结合情况来问接判断DNA序列的组成，从而达到鉴别菌种的目的。通常情况下，对单核苷酸多态性位点的选择主要考虑能够将临床最常见的NTM鉴别出来的位点，因此，用于菌种鉴定的商业试剂盒能够解决主要的临床需求，但对于临床较为少见的菌种或是当进一步区分亚种对临床有指导意义时，仍需借助其他方法进行鉴定。本方法虽然鉴别能力较直接的基因序列分析弱，但简化了操作，并且具备鉴定临床常见NTM的能力，因此具有临床应用价值。应用商业化的分子菌种鉴定试剂盒的注意事项：①目前商业化的菌种鉴定试剂盒仅能鉴别临床最常见NTM中的部分菌种，因此对于分离NTM菌种较多的地区，建议对无法鉴定的菌种进一步采用其他方法鉴别。②目前的商用试剂盒主要用于分离株的鉴定，由于获得培养物时间较长，无法及时为临床提供信息；虽然有些试剂盒也可用于涂片阳性临床标本的检测，但当菌量较少时，存在检测失败的风险。