艰难梭菌感染的实验室检测技术及临床意义（上）

艰难梭菌（Clostridium difficile, CD）又称难辨梭状芽孢杆菌，广泛分布于自然环境、人类和动物的粪便中，是医院内肠道感染的重要致病菌之一。艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection, CDI）患者的临床表现可为自限性腹泻，重者可出现伪膜性肠炎，甚至中毒性巨结肠。临床大量不合理使用广谱抗生素、免疫抑制剂、质子泵抑制剂或化疗药物后，破坏人体正常的肠道微生态平衡，致CD过度生长并释放肠毒素、细胞毒素和二元毒素，引起CD相关性腹泻（Clostridium difficile associated diarrhea, CDAD）。

近年来由于出现新型高产毒株027/NAPI/BI型CD，欧洲和北美相继发生暴发流行，给临床诊疗提出了新的挑战；同时高发人群除住院及老年患者外，尚有既往身体健康未曾住院且未用过抗生素的人群，社区获得性CD感染的病例数呈逐年上升趋势，并在获得的菌株中既发现了与院内感染同源的高致病株也有新型菌株和新的毒力基因，因此已引起全球高度关注。

快速、敏感、准确的实验室诊断对确定CD感染病源、发现CD流行病学变化、控制其传播、确保有效治疗显得极其重要。

一、粪便厌氧培养

CD属专性厌氧菌，对培养基的要求较高，需要用环丝氨酸－头孢西丁－果糖琼脂（cycloserine-cefoxitin fructose agar，CCFA）作选择性培养基。在厌氧环境中CCFA平板上18～24ｈ后，长出黄色毛边样粗糙菌落，紫外线照射下可见黄绿色荧光。加有牛磺胆酸钠的环丝氨酸头孢西丁果糖肉汤（taurocholate cycloserine cefoxitin fructose broth, TCCFB）可富集芽孢，用无水乙醇处理，离心取沉淀再接种于CCFA中厌氧培养，阳性率可明显提高。另外成本较低的改良CD布鲁琼脂（Clostridium difficile blue agar， CDBA）和CD布鲁肉汤（Clostridium difficile blue broth， CDBB）培养基可达到与CCFA相当的分离率，而原型显色培养基（IDCD）对新鲜粪便标本和经乙醇处理过的粪便标本分离率明显高于其他选择性培养基，是一种值得推荐的新方法。粪便培养厌氧要求高，所需时间长，只有小部分实验室能进行，多次粪标本送检可提高阳性率，其优点是能进行抗菌药物敏感性检测，并可对分离的菌株进行分子生物学分型和流行病学分析，但不能确定其是否产生毒素。

二、细胞毒性实验（cytotoxicity assay, CCTA）

CCTA是检测单层培养细胞由毒素所致的变性、坏死、凋亡等细胞病变效应。将粪便滤液与Vero或HepG2细胞一起孵育，分别加入和不加入抗毒素A/B的中和抗体，然后分别在24、48ｈ显微镜下观察是否有细胞病变效应，而加入抗毒素抗体能阻止这种细胞病变。若50%以上的病变细胞在48ｈ内可以被中和，则为阳性。该法可以检测到1 pg水平的毒素，灵敏度为67%～90%，被认为是传统实验室确诊CDI的“金标准”。由于需要相应设施和技术，且耗时长，结果带有一定的主观性，也难以在临床常规实验室应用。

三、毒力生成细胞培养试验（toxicity generation cell culture test, TGCC）

TGCC是厌氧培养与毒素B检测相结合的一种方法。粪便标本处理后，用选择性培养基对CD孢子进行厌氧纯培养，然后检测毒素。由于其灵敏度要高于传统金标准CCTA，美国食品药品监督管理局要求在进行CD检测新方法评价时须将TGCC作为参比方法。但TGCC的特异性低于CCTA，检测时间长。