案例分享：三代测序对PRV、PCV2、PPV6混合感染的诊断

1.下机数据量统计

    使用NanoPlot对测序结果进行质控分析（见图2），共获得10.5万条序列（即reads数），合计46Mb碱基，平均序列长439.6bp，最长一条序列达到30Kb。

图2 NanoPlot质控分析图

2.物种分析

    对下机数据进行物种分析，结果显示（见图3、表1），PRV和PCV2都有大量序列被检出，这与荧光结果一致，尤其是PCV2，检出的序列数达到7643条，占样品中所有病毒序列的82.7%（即微生物丰度）。PRV检出143条，微生物丰度为1.55%。PPV6（Porcine parvovirus 6）检出347条，微生物丰度为3.76%

图3  物种分类图

表1 MinION下机数据物种分析

#对于宏基因组数据分析来说，除了考虑检出的reads数以外，其他重要的指标还包括覆盖度（coverage）以及测序深度（depth），这两个指标是相对于参考病毒基因组全长而言的。

#覆盖度（coverage）就是指检测到某种微生物的序列覆盖到该微生物全基因组的比值，覆盖度越高表示检测到某微生物的序列覆盖到该微生物全基因组的比值越高，也就越有可能就是该种微生物。

#测序深度（depth）是指样本中某个指定的核苷酸被检测到的次数，数值越大表示样本中检测到该碱基的次数越多，可靠性也就越高。

    2.1 PCV2

    从表1的结果来看，PCV2的覆盖度达到参考序列的100%，平均测序深度更是达到了1800次以上（见图4），说明该样品中PCV2的检测结果非常可靠，而且一个测序反应即拿到了病毒的全基因组。

图4 PCV2的覆盖度及测序深度

    2.2 PRV

    PRV本次测序获得的序列与参考基因组相比覆盖度不足50%，平均深度不足1%（见图5），但考虑到PRV的基因组较大，达到150Kb，50%的覆盖度也相当于测到了近70Kb的片段，因此认为该物种的检出结果也比较可靠。

    2.3 意外发现的PPV6

    意外的是，在对下机数据进行物种分析时，还发现347条猪细小病毒PPV6序列，微生物丰度甚至超过了PRV，达到3.76%，与参考序列相比覆盖度竟然达到100%，平均测序深度超过80（见表1和图6）。

图6 PPV6的覆盖度及测序深度

3.PPV6的背景调查

PPV6是2014年由Jianqiang Ni等(Ni and Qiao et al., 2014)首次在我国发现。

图7 PPV6 进化树（参考文献2）

随后2015年，美国学者通过病毒宏基因组测序，在美国和墨西哥的多个地域发现该病毒(Schirtzinger and Suddith et al., 2015)，并且与中国天津健康猪中获得基因序列同源性最高。2017年波兰报道检出该病毒(Cui and Fan et al., 2017)。至此，世界范围亚洲、欧洲、美洲均有该病毒的流行。尽管该病毒感染可能产生的相关临床症状仍有待进一步确定，但其流行范围及流行率还是比较高的。中国报道的回顾性流行病学调查中发现该病毒在育肥猪和母猪中的流行率分别为15.6%和3.8%，而在流产胎儿和仔猪中的流行率达到50%和75%，并且与其健康状况无关。同时，出现繁殖障碍的猪场流行率为16.7%，而无繁殖障碍的猪场流行率在13.6~21.7%。美国报道的流行率为13.2%，波兰的流行率为14.9%。

本案例结果表明，在病毒感染的临床样品中，造成感染的病毒微生物丰度通常很高，通过纳米孔测序对该类样品进行检测和诊断时，不受目标病毒种类的限制，可真正做到“一网打尽”。