老师都没教过的PCR实验室辅料质检

    昨晚我和我的两个助理一起讨论完这个主题后，一个助理得知闺蜜生病，心急如焚又帮不上忙。我在这里祝愿助理的闺蜜早日康复！

    在之前的文章中（#检测全流程的质量控制）已经探讨了扩增试剂、PCR仪、提取试剂乃至采样拭子的评价方式。今天我们继续探讨PCR实验室最容易忽视的环节，对试验辅料进行质检。PCR实验室的辅料指的是PCR实验中常用的一些辅助试剂和耗材，比如采样管、拭子、离心管、PCR管、吸头、移液器、无核酸酶水和试管架等。

一.辅料质检的基本原则

辅料的质检通常是在新一批的辅料到实验室后统一做一次或者定期（半年或1年）做，因此质检就包含了验货和质检2个部分。由于辅料的质检没有一个统一的标准，一般由各实验室自行制定，可简可繁，这里提出一些方法供大家参考和批评指正。

1.外包装检查：外包装应完整无损无污，标识清楚，检查品名、品牌，货号，规格、生产日期，有效期、保存条件等信息。

2.内包装检查：内包装物品应与外包装标识一致，检查是否有破损，泄漏，内容物是否齐全，是否有相应的使用说明书等。

3.性能质检：检测试剂耗材是否与其性能一致，比如吸头的准确性和气密性等

4.污染物质检：检测试剂耗材是否被常规检测项目的待检物污染，这种污染可能是物品生产环节，也可能是运输或实验室的保存过程中被污染。

5.抑制物质检：检测试剂耗材中是否存在PCR反应的抑制物，比如核酸酶。

二.辅料质检的前提条件

1.弱阳性质控：需要准备弱阳性质控，包括标准物质、第三方质控或弱阳性样品用于进行性能质控和抑制物质控。

2.阴性质控：需要准备确定阴性的样品或空白对照，用于进行污染物的质控。

3.重复次数n：中国人喜欢3(三顾茅庐),6（六六大顺）,8（發發發）,9（九九归一），很遗憾这些数和实验室都关系不太大。符合统计学计算的最常用的两个数字是5和20,5通常是能进行统计学分析的最少重复次数，20通常用于计算95%的置信区间。大家根据自己的需要选择合适的重复次数。

三.常见辅料的质检

辅料的质检应结合实际工作中可能用到的场景，并非越苛刻越好，需要每个实验室结合自身情况来设计和调整文中提到的参数。

1.离心管：

（1）渗漏密闭性：将n个离心管加入半量墨汁，盖好盖子后放入水中，浸泡30min，没有墨汁渗出为合格。

（2）离心密闭性：将n个离心管加入半量纯水，放入离心机，10000 rpm，30min，管盖未崩开未漏液为合格。

（3）热密闭性：将n个离心管加入半量纯水，盖好盖子称重后放入金属浴中，65℃或90℃（巴氏消毒），30min，再进行称重，离心管未变形，管盖未崩开未漏液，前后重量未变化为合格。。

（4）冷密闭性：将n个离心管加入半量纯水，放入-20℃冰箱，24h，离心管未变形，管盖未崩开未漏液为合格。

（5）污染物质检：将n个离心管分别加入半量阴性纯水，盖好盖子涡旋1 min后静置5min，吸取纯水作为模板进行扩增，qPCR无扩增为合格。

（6）抑制物质检：将n个离心管分别加入弱阳性质控物,室温静置5min，然后进行提取;RNA核酸，DNA核酸，室温静置5min，作为模板进行扩增，qPCR扩增未被抑制为合格。

2.PCR管：

（1）渗漏密闭性：将n个PCR管加入半量墨汁，盖好盖子后放入水中，浸泡30min，没有墨汁渗出为合格。

（2）离心密闭性：将n个PCR管加入半量纯水，放入离心机，1000 rpm，30min，管盖未崩开未漏液为合格。

（3）热密闭性：将n个PCR管加入半量纯水，盖好盖子称重后放入PCR仪，设置一个常用的PCR程序，程序运行完毕后，再进行称重，PCR管未变形，管盖未崩开未漏液，前后重量未变化为合格。。

（4）冷密闭性：将n个PCR管加入半量纯水，放入-20℃冰箱，24h，离心管未变形，管盖未崩开未漏液为合格。

（5）污染物质检：将n个PCR管加入半量阴性纯水，盖好盖子涡旋1 min后静置5min，作为模板进行扩增，qPCR无扩增为合格。

（6）抑制物质检：将n个PCR管分别加入弱阳性质控物,室温静置5min，然后进行提取;RNA核酸，DNA核酸，室温静置5min，作为模板进行扩增，qPCR扩增未被抑制为合格。

（7）空白荧光通透性：对于qPCR,需要考察PCR管是否有非特异性荧光信号，将n个空PCR管，盖好盖子后放入PCR仪，设置一个常用的PCR程序，程序运行完毕后，qPCR无扩增为合格。

（8）阳性荧光通透性：对于qPCR,还需要考察PCR管是否会抑制荧光的通透性，将n个含弱阳性样品和扩增试剂的PCR管，与确认无荧光干扰的PCR管，盖好盖子后放入PCR仪一同扩增，设置一个常用的PCR程序，程序运行完毕后，qPCR扩增未被抑制为合格。

3.滤芯吸头：测试吸头需使用经校准的移液器

（1）准确性：将n个吸头分别吸取定量的纯水称重，重量与体积的关系按照1 g/mL换算。

（2）气密性：取n个吸头，吸取最大量程的含有1％甘油的墨水，观察有色液体不出现在滤塞之上，液面相同为合格。

（3）防气溶胶性能：取n个吸头，吸取阳性核酸，反复吹吸10次，换另一个新吸头在阴性纯水中反复吹吸10次，取阴性纯水作为模板进行扩增，qPCR无扩增为合格。

（4）污染物质检：取n个吸头，吸取阴性纯水反复吹吸10次，取阴性纯水作为模板进行扩增，qPCR无扩增为合格。

（5）抑制物质检：取n个吸头，吸取弱阳性质控物反复吹吸10次，然后进行提取;吸取RNA核酸和DNA核酸反复吹吸10次，作为模板进行扩增，qPCR扩增未被抑制为合格。

4.采血管、采样管、采样拭子和一次性吸管等：主要考察污染物和抑制物

（1）污染物质检：将n个耗材加入一定量阴性纯水，盖好盖子涡旋1 min后静置30min，吸取纯水作为模板进行扩增，qPCR无扩增为合格。

（2）抑制物质检：将n个耗材分别加入弱阳性质控物,室温静置30min，然后吸取质控物进行提取;作为模板进行扩增，qPCR扩增未被抑制为合格。

5.无核酸酶水、PBS等缓冲液：

（1）PH值：测量各缓冲液的PH值。

（2）污染物质检：吸取缓冲液作为模板进行扩增，qPCR无扩增为合格。

（3）抑制物质检：将缓冲液分别与RNA核酸和DNA核酸混合，然后吸取混合液作为模板进行扩增，qPCR扩增未被抑制为合格。

6.移液器和离心管架及离心机的内外表面：这些常见物品的外表面容易被核酸和细菌污染，主要查看这两个指标。

（1）表面核酸污染：用沾湿的拭子擦拭上述物品的外表面，然后浸泡到纯水中10min，吸取纯水作为模板进行扩增，qPCR无扩增为合格。

（2）移液器内腔核酸污染：对于常用的移液器的内部，可使用无滤芯的吸头在阴性纯水中吹吸10次后，吸取纯水作为模板进行扩增，qPCR无扩增为合格。

（3）表明细菌污染：用沾湿的无菌拭子擦拭上述物品的外表面，划琼脂平板，每个平板的菌落数不应超过一定数量（我也不确定多少合适，由于不要求无菌操作一定会有细菌，但是也不应该太多）。

    非瘟和新冠后全国一下子新增了很多核酸检测实验室，早期大家关注的点都在设施和硬件上，但是一个检测实验室开展大量检测工作之后，检测中最弱的环节决定检测的质量。我们也需要将精力放在检测中的每个细节上。