【新型冠状病毒】病毒性肺炎发病机制对新型冠状病毒核酸检测的提示 ...

一、病毒性肺炎的流行与发病机制

（一）病毒性肺炎的流行

病毒感染一直是社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia, CAP）的重要因素，估计全球每年有超过1亿病毒感染导致的CAP病例，其中成人与儿童各占50%左右^[6]。病毒性肺炎相关病原体包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、鼻病毒、腺病毒、副流感病毒等，在部分发达国家巨细胞病毒（Cytomegalovirus,CMV）、疱疹病毒肺炎较多，而非洲等发展中国家则存在结核、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）与病毒重叠感染^[6,7]。新发病原体如人感染禽流感病毒H5N1、H7N9，SARS，MERS，以及博卡病毒、冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1引起的肺炎时有发生^[8]。

（二）病毒性肺炎的发病机制

病毒性肺炎的发病机制阐述多不清晰，但基本包括：（1）病毒吸附与建立感染阶段，此时病毒与呼吸道黏膜上皮细胞结合，进入上皮细胞后建立感染并复制，此时病原体的传播能力、数量、致病力、黏膜天然免疫屏障决定了感染的建立及严重程度，若感染局限则无症状或仅引起上呼吸道症状^[9]。（2）感染扩散阶段，此时病毒大量复制、沿呼吸道侵袭周边细胞或进入血流，病毒及其产物刺激免疫细胞产生保护性抗体或通过细胞免疫机制限制感染扩散^[10]。中和抗体的存在可以有效终止感染扩散，如注射流感疫苗者不易患感冒。但现阶段人体普遍缺乏针对2019-nCoV的保护性抗体，进入感染扩散阶段后患者病情较重或病程较长。（3）当患者抵抗力下降、过度劳累或病毒毒力较强时出现下呼吸道感染（lower respiratory tract infections, LRTI），或通过刺激免疫细胞释放大量趋化因子、炎症因子引起细胞因子风暴，造成肺和免疫器官等多器官损害，如H7N9、2019-nCoV、SARS重症患者，导致病毒性肺炎甚至呼吸衰竭^[6,11]。

目前已阐明2019-nCoV通过与肺泡上皮的血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)-2结合进入人体，该途径与SARSr-CoV感染一致，最新研究已证明炎症因子风暴参与了肺泡水肿或炎症渗出等肺部病变^[3,12]。2019-nCoV引起的上呼吸道症状不典型，而以下呼吸道、肺部炎症为主，临床表现如肺部影像和胸闷、呼吸窘迫等症状均显示主要病变在下呼吸道^[5]，检测2019-nCoV的最佳标本应来自于下呼吸道。

二、病毒性肺炎的实验诊断

人类对病毒性肺炎的早期认识建立在电子显微镜、病毒培养和血清学基础上。一般病毒感染后免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）抗体可在感染1～2周产生，可保留3～6个月；免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗体在感染后2周产生，一般持续多年^[13]。经典流行病调查推荐使用感染者急性期及恢复期血清检测IgG抗体呈现4倍增长。但抗体产生有延迟，加上特异性诊断试剂研发需要时间，因此免疫学手段难以实现对感染的实时监测，对类似2019-nCoV引起的突发传染病难以实现前瞻性监测。对病毒的抗原检测可以实时监测病毒感染，但需要有标记的特异性抗体，一般使用原始呼吸道标本或使用病毒培养后的细胞检测，需要注意假阳性或假阴性导致的误诊。

（一）核酸检测在病毒性肺炎诊断中的作用

基于核酸的检测技术如实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）或反转录（reverse transcription, RT-PCR）、基因芯片、等温扩增等一系列技术的应用开启了对病毒性肺炎的认识空间^[6,14]。核酸诊断对病毒检测具有天然优势，联合测序还有助于发现新的病毒及病毒变异株^[15]。核酸检测时效与临床诊疗时间窗吻合，可以用于治疗效果的评估及预后分析，在SARS、季节性流感、H7N9人感染禽流感等诊疗指南或规范中，均明确了核酸检测的价值^[11,16]。多重检测平台的应用有助于一次性检测多种病原感染，发现合并感染及病原体间的相互作用，降低检测成本，提高检测效率。宏基因组技术对发现新病原体及混合感染有很大优势，在2019-nCoV流行初期辅助锁定了病原体。

（二）病毒性肺炎核酸检测的问题

对肺炎病毒的核酸检验质量控制难度大，迄今无统一标准。从检验前方面，标本质量是核心，但临床一般以上呼吸道标本代替下呼吸道标本^[1,5]，这样可导致假阳性或假阴性结果。上呼吸道标本中病毒核酸阳性可能是下呼吸道感染的直接原因，也可能是标本污染、定植，或者是下呼吸道感染真因之外的间接因素^[7,17,18]。反之，阴性的结果可能是相应感染确实不存在，但也可能是标本质量不合格造成的假阴性。就检验中而言，各试剂厂家推荐的标本前处理方法及核酸提取方法并不统一，有的对标本进行灭活处理，有的直接检测；有的用标准病毒采样管，有的用盐水洗刷拭子；有的用离心柱提法或者磁珠法，而有的则是用直接裂解法。此类问题从源头影响检测质量并且继续存在于2019-nCoV的检测中。

这些因素决定了病毒性肺炎核酸检测难以实现定量分析，因为病毒载量和取样标准化密切相关，个别检测试剂中加入标本内参基因，其意义更多在于对检测有效性的判断，而不是定量。

因此，病毒的核酸检测结果应该结合患者的临床表现，以及流行病学背景分析。当患者有流行病学史，有典型临床症状与影像学表现，同时核酸检测阳性时可以确诊。核酸检测阴性时应结合多方因素分析，避免假阴性结果带来的误诊^[19]。

三、2019-nCoV核酸检测的问题及分析

核酸检测成为全球监测2019-nCoV流行，以及临床诊疗的必备实验。为保障检验质量，各厂家试剂盒内均备有阳性与阴性对照品。国家卫生健康委发文《关于新型冠状病毒核酸检测的要求》包括了质控要求，既检测时包括3个随机阴性质控与1个弱阳质控，第三方机构已经安排了室间质评。在检验中质量得到有效保证的前提下，面临特殊核酸检测结果及应用时，更应该结合发病机制理性分析。

（一）无典型症状者的发现及检测

1．无典型症状感染的免疫背景：

此次2019-nCoV感染患者上呼吸道症状如流涕、喷嚏等不明显，有的患者在没有临床症状的情况下出现肺部阴影及核酸检测阳性，这部分人群作为流动传染源很难被发现。及时发现这些隐匿感染者对控制2019-nCoV有重要意义，核酸检测甚至为此受到诟病。从机制上分析，感染建立是病原体与机体互相作用的过程，存在病毒与免疫之间的相互作用，极端的情况是无症状定植，此时检测到低拷贝核酸，这弱阳性结果是否等同于病毒培养阳性或具备传播能力值得研究分析。

2．对无典型症状者的筛查措施：

从控制传染原的角度，应该对无典型症状者、需要居家隔离的暴露人群或密切接触者进行筛查，以便早发现、早隔离，但这类检测任务量大并且阳性率很低。不妨借鉴血站核酸检测时的多人份合并送检方式，这样有助于扩大筛查对象，降低筛查成本。

特异性抗体是感染的直接证据，报道显示2019-nCoV特异性IgM抗体是对核酸检测的补充。但对于轻症感染者是否能产生足够检出限的抗体，2019-nCoV感染者的抗体窗口期，以及与其他冠状病毒感染是否有交叉反应等仍需进一步研究，但是2019-nCoV特异性IgM或IgG检测高度值得期待。

（二）检验前因素对核酸检测的影响

1．取材对检验结果的影响：

决定病原体检测的关键因素是取材质量，对2019-nCoV的检测亦是如此。因为病变表现主要在下呼吸道，理论上应该用深部痰液或肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）等下呼吸道标本进行检测，但因院内感染控制及普及性等原因，实际操作时多使用鼻咽或口咽拭子。取材时推荐使用尼龙植绒拭子，表面有细小毛刷，口咽部取材时应将拭子越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处反复擦拭3～5次，收集表面黏膜细胞，也可以对同一患者采取多部位的标本合并送检（如口咽拭子与双侧鼻咽拭子合并送检），有助于提高检测效果。

2．炎症因子风暴可能对核酸检测产生影响：

2019-nCoV患者的肺部渗出可能由于炎症因子风暴导致，此时，过强的免疫反应可以快速清除病毒，但临床上患者病情却很重。这种免疫诱导发病机制在暴发性病毒性肝炎也可能遇到^[20]。第五版指南考虑到在流行地区对有肺部典型症状但核酸阴性者做临床诊断，避免了重症患者漏诊。对类似重症患者有必要考虑送检深部痰液或BALF。

3．送检时间的探讨：

在疾病极期病毒复制迅速，核酸检测阳性率高。在试剂和检测人力都有限的情况下，选择极期患者做检测很必要。对于按甲类管理的传染病，疑似2019-nCoV感染者有必要重新留样或留取多部位标本复测。

2019-nCoV的检测虽然无法定量，但扩增时循环阈值（cycle threshold, CT）值低提示送检标本的病毒量高，对这类患者务必做好传染原管理，避免医护、密切接触者感染；反之，CT值高说明病毒量低或取材质量差，随着患者病情恢复，检测的CT值可以由低转高，此时，患者作为传染原的价值也降低^[21]。

（三）病毒血症及核酸转阴的分析

1．病毒血症是发病过程的常见表现：

从病毒性肺炎的发病机制可知，病毒性肺炎时的病毒血症并不少见，而尿、便检测到病毒核酸也多有报道。如SARS、腺病毒、CMV感染者外周血、尿液及粪便排毒均有报道^[22]，H7N9人感染禽流感存在病毒血症，2009年H1N1甲型流感病毒感染者尿液中检测到病毒核酸。上述情况与病毒大量复制有关，当疾病进入恢复期后病毒血症很快消失。但免疫缺陷人群如HIV感染或肿瘤患者可能存在长期病毒携带状态。因此，对免疫功能缺陷患者感染2019-nCoV后应进行持续评估，避免慢性排毒，造成环境污染。

2．核酸检测由阳转阴者是否具有传染性：

当前尤为关注的是两次核酸阴性出院的患者是否携带病毒。一般核酸转阴患者同时存在临床症状好转，加上呼吸道标本的病毒核酸转阴，且需要间隔至少一日两次检测均阴性，间接表明患者已停止排毒。目前包括SARS、流感、禽流感肺炎均按此方案判定治愈。病毒感染者恢复期体内产生保护性抗体，加上免疫细胞作用，足以抑制并破坏体内病毒，使其不再具有感染性。在少数患者粪便中检测到病毒核酸，这不等于有活性病毒，因为大量被破坏的病毒释放核酸后经过消化道排出体外。

综上所述，2019-nCoV作为刚刚跨越种属感染人类的病原体，尽管已有不少文献对其病原学、临床表现等进行研究，但检验方面的研究包括核酸检测、合并感染及体液与细胞免疫等方面仍有很多空白，以上针对2019-nCoV核酸检测的反思，希望对疫情防控有一定帮助。