检验医学与感染病学（七）——感染性疾病的分子诊断

        作者：黄山

单位：贵州省临床检验中心

血流感染是一种严重的全身感染性疾病，血培养仍是目前诊断细菌性血流感染的金标准，但仅有30%～40% 的血流感染可通过培养发现致病菌。血培养的阳性检出率不高，检测时间过长( 阳性报警需要 1～ 5 d，甚至更长) ，无法满足临床早期、快速诊断以指导治疗的需要。同时也不适合临床实验室对不易培养的微生物的及时检出，如军团菌属、巴尔通氏体属和曲霉属真菌等。分子生物学检测技术的发展旨在增加病原体检测的敏感性和特异性，扩大检测的病原谱，缩短检测时间，减少抗菌药物对病原体检测的抑制作用。理想的分子生物学方法可通分析患者的血液标本，快速提供准确的细菌、真菌或病毒感染信息，甚至提供常见致病菌的耐药基因检测结果，指导临床医生及时、准确地使用抗菌药物。更为理想化的结果是对全血标本检测的同时提供感染细菌的定量等数据，用于评估微生物治疗后的血液清除率。当前，应用于临床实验室血流感染检测的分子生物学技术主要包括基于病原微生物 DNA 或ＲNA 的 检 测 技 术 如 核 酸 杂 交 ( nucleic acidhybridization) 、核酸扩增及 DNA 序列分析、基因芯片和以蛋白质组学为基础的质谱检测技术等。

核酸杂交是指具有一定互补序列的2条核酸单链在液相或固相体系中按碱基互补配对原则形成同源或异源双链分子的过程。核酸杂交可在DNA 与 DNA、ＲNA 与 ＲNA 或 ＲNA 与 DNA 的 2条单链之间进行。其中，荧光原位杂交技术应用于临床实验室鉴定工作已有 10 余年，其检测的敏感性和特异性可达到 96% ～100%。在第 1 代荧光原位杂交技术( peptide nucleic acidfluorescent in situ hybridization，PNA-FISH) 的基础上，第 2 代 荧 光 原 位 杂 交 技 术 ( quick-fluorescent in situ hybridization，Quick-FISH) 已能更好地满足临床实验室对操作简便、快速的需求。不同于美国研发的第1代 PNA-FISH检测技术，Quick-FISH 省去了杂交后的 30 min 清洗环节，采用了“自我报告”探针，同时将杂交时间节省到了15min。这将大大提高对血培养阳性的革兰阴性细菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌，以及革兰阳性细菌如金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌的检测效率，同时简便的操作也将更有利于该技术的推广。

PCＲ 已成为分子生物学及其相关领域的经典试验方法，由PCＲ演变的相关核酸扩增技术也逐步在临床微生物学检验领域得到应用。PCＲ在血流感染微生物检测和鉴定中的应用体现在 3 个方面:一是对分纯的病原菌鉴定；二是对血培养阳性培养物快速鉴定；三是对临床标本中难以培养病原菌进行检测和鉴定。可通过 2 种方式检测和鉴定病原微生物，一是使用特异引物扩增检测病原微生物目标基因；二是使用通用引物扩增检测细菌 16S rＲNA 和真菌 ITS 及 5.8S、26S rＲNA 等基因 D1/D2 序列，同时进行测序分析。检测特异性目标基因需要合成相关病原微生物的特异性引物或购买有关试剂盒，核酸扩增反应体系条件不尽相同。对布鲁菌 bcsp31 基因设计特异性引物，可以通过 PCＲ的方式快速检测血液、组织等标本中的布鲁菌，敏感性和特异性分别达到70．4%和98．3%。使用通用引物扩增检测细菌 16S rＲNA 基因，再进行基因序列测定、计算机分析和比对，最终鉴定病原微生物，其核酸扩增反应体系条件较易掌控，应用范围广，可以发现新的菌种。不动杆菌属血流感染患者研究发现，使用 PCＲ 方法可以快速检测血培养阳性瓶中的鲍曼不动杆菌等。对于碳青霉烯类常见的耐药突变基因 blaOXA-51-like进行测序，有助于早期报告耐药菌以提示临床合理用药。对全麻拔牙患者的血流感染风险研究显示，使用通用引物检测全血标本中的16S rＲNA，结合焦磷酸测序技术可以很好的发现草绿色链球菌等，对于评估血流感染有重要意义。血流感染病例中发现，使用高分辨率熔解曲线分析( high-resolution melt analysis，HＲMA) PCＲ 检测沙门菌的 16S rＲNA 可有效地检出致病菌。

实时荧光 PCＲ 对于传统 PCＲ 技术进行的改进是为了提高PCＲ的敏感性、特异性和检测速度以及避免污染。实时系统提供了一个封闭的环境，运用荧光共振散射转移探针、分子信标或TaqMan 探针( Ｒoche molecular systems) 检测扩增产物。分子信标探针是单股探针，内部有识别序列，当该分子信标探针与含核酸补充序列PCＲ 产物接触，探针即打开与 PCＲ 产物结合，其内所含的报告基团释放荧光指示剂，即可产生可测量的荧光信号。随着 PCＲ 反应的进行，荧光信号不断累积。目前，实时荧光 PCＲ 已经广泛应用于血液中乙型肝炎病毒( hepatitis B virus，HBV) 、丙型肝炎病毒( hepatitis C virus，HCV) 、人类免疫缺陷病毒( human immunodeficiency virus，HIV) 等病毒检测。在血流感染致病菌检测方面新产品不断被开发推广。

基因芯片也称 DNA 微阵列( DNA microarray) ，可分固相基因芯片和液相基因芯片。基因芯片检测基本原理是将已知的核酸片段固定在一定的固相支持物表面制成核酸探针，利用碱基互补原理，使其与待测 DNA 标本进行杂交反应，从而获得需要的生物学信息。与传统的核酸印迹杂交方法相比，基因芯片检测技术具有高通量、多参数同步分析、快速全自动分析、高精确度和高敏感性分析等显著特征。液相基因芯片是近年来发展出的一种新的芯片技术，与固相芯片相比，液相芯片在反应动力学、反应速度、检测敏感性、稳定性以及自动化程度方面都有较大的优越性。目前，检测病原体的芯片技术对靶基因的选择有 2 种策略: 一种是选择细菌的核糖体基因( 如16S rＲNA) ，另一种是选择细菌的“特异基因”。基因芯片也可用于病原微生物耐药基因的表达谱检测、突变分析等。目前，商品化基因芯片血流感染病原体检测均应用于阳性血培养物。芯片技术快速、高通量、灵敏的优势使其具有极大的应用前景。

除了基因分析，蛋白组学作为一种日益重要的技术已应用于病原微生物的鉴定和分型分析。近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( matrix assisted laser desorption ionization time offlight mass spectrometry，MALDI-TOF MS) 技术在细菌和真菌等微生物鉴定中的应用受到广泛关注。质谱技术主要是利用特定离子源将待测标本转变为运动的离子，这些离子根据质量/电荷比的不同，在电场或磁场作用下得到分离，并用检测器记录各种离子的相对强度，形成质谱图，通过与已知数据库进行匹配，匹配率最高的为未知微生物的鉴定结果。它具有高敏感性、高通量和快速的特点，但由于其对未知微生物的鉴定是通过所获得的质谱图与已知数据库进行匹配分析来实现的，不同的标本制备方法对获得的待测标本质谱信息有明显影响，而相关数据库的构成和质量则影响鉴定的准确性。PCＲ-HＲMA ( PCＲcoupled to high resolution melting curve analysis) 检测技术和 PCＲ-ESI-MS 方法时发现，两者在检测致病菌的敏感性均能达到 90.0% 以上，PCＲ-ESI-MS 的特异性能达到 98.5%，但是 PCＲ- ESI-MS 可以有效地检测多种致病菌混合感染的标本。与 MALDI-TOF-MS 比较，在菌属和菌种水平正确率 PCＲ-ESI-MS 均高于 MALDT-TOF-MS，在血培养阳性细菌的鉴定能力和速度上 2 种技术无明显差别，均显示了快速、准确的优势。在培养阴性或难培养的致病菌检测方面，PCＲ-ESI-MS 能够诊断并定量。然而，该技术极其昂贵的仪器和封闭试剂成为在发展中国家甚至欧美国家临床实验室应用最大的瓶颈。

随着获得性免疫缺陷综合征和结核病疫情的日益严重，在临床发现的分枝杆菌血流感染病例越来越多，已经成为临床诊断、治疗的一个难点，早期诊断的需求异常紧迫。结核分枝杆菌生长缓慢，其快速、准确的检测和耐药性分析越来越成为实验室进行结核诊断的重点。在 GeneXpert MTB/ＲIF assay 检测仪器的基础上，对血流感染的分枝杆菌进行了研究。痰培养分枝杆菌阳性患者的血液标本检测阳性率为 21%，2 周后血液标本检测阳性的患者死亡率显著高于阴性患者。对 GeneXpert MTB/ＲIF 检测系统检测分枝杆菌能力做了进一步的评估，使用卡介苗作为模式菌，在血液标本中进行检测，细菌浓度分别为10、5、1 和 0.25 cfu / mL时，检测的敏感性分别达到 100%、100%、83%和 57%，而同样浓度的细菌在 1 mL 血液标本的检测敏感性只能达到 100%、66% 、18% 和 18% 。研究发现血液标本中往往能检测到 MicroＲNAs ( miＲNAs) ，这也是分枝杆菌感染的重要检测标志物。对于活动性肺结核患者的血液标本研究发现，与疾病相关的 miＲNA-29a可能作为区分结核感染和健康人群的特异性指标，对于诊断活动性肺结核具有重要意义。这也必将为分枝杆菌，甚至苛养菌、少见菌等难培养细菌的血流感染提供了一个新的发展思路。随着对微生物基因组学和蛋白质组学了解的深入，相信在不远的将来，人们能够快速、准确地对血流感染病原体同步进行检测、鉴定及药物敏感性测定，分子技术将成为血流感染诊治必不可少的重要工具。多种检测技术的联合应用，对血流感染病原菌的快速检测以及常见耐药基因的快速检测，必将能实现在较短的时间内( 1 d，甚至数小时) 为临床实验室提供可靠的血流感染诊断结果，有效地提示临床合理用药、及时诊治，有效提高血流感染患者的生存率。

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的全球问题，我国是乙型肝炎的高发区,每年约有10%～20%的急性乙肝将转成慢性肝炎,肝硬化甚至发展成肝癌,严重威胁着人们的健康，急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌变的发生机制是多年来肝病研究的重点。HBV的基因组是已知DNA病毒中最小的，仅含3200bp，组成独特的带有部分单链区的双链DNA环状模式。长链为负链，几乎形成完整的环，其5’末端有蛋白与之共价相连。短链为正链,长度因毒株的不同而变化较大,其5’末端有一段戴帽的寡核苷酸与之相连。因此长链与短链的5’端均不能被多聚核苷酸酶磷酸化。长链和短链的5’端的位置是固定的,短链可长可短。尽管短链的3’端长度有不同,但通过正、负链的5’端的粘性末端互补,使HBV基因组DNA形成部分环形结构。在正、负链的5’端的互补区的两侧各有由11个核苷酸构成的同向重复,分别称为DR1和DR2,其中DR1在负链的5’端, DR2在正链的5’端。HBV基因组非常独特,正链及负链DNA可分别编码,所有顺式调控序列均位于编码区内,无内含子。HBV DNA长链含有分别编码结构蛋白(pre-S、S和核心蛋白)以及复制蛋白(聚合酶和X蛋白)的4个ORF,编码区有广泛的重叠以充分扩大其编码容量。HBV基因组高度压缩,重复利用,使有限基因得到充分的利用。

HBV感染的病原学诊断目前主要依靠免疫血清学检测HBV的血清学标志物和分子生物学方法检测HBV核酸。免疫学方法测定病毒抗体是一种快速简便的检测手段,常用的方法是间接ELISA,目前我国HBV检测采用的第三代ELISA试剂由多种病毒抗原组合匹配,具有较好的灵敏性和特异性,但其在病毒感染的窗口期不能检测到抗体,这在很大程度上限制了ELISA检测的准确性,不能有效的控制病毒的传播,因而,发展新的诊断HBV感染主要依赖分子生物学技术对病毒DNA的检测。

1.PCR基因分型法   一种在临床上准确、快速、简便地对乙型肝炎病毒进行基本分型(BCD)的方法,该方法通过大量分析已分型的HBV基因组序列,寻找出HBV各基因型的型特异性硷基的分布规律,设计型特异性的引物和探针,利用已知全序列HBV建立荧光PCR的基因分型方法,结果显示其与基因组分型完全一致,与PCR-RFLP相比,分型结果一致性在84.0%；与S基因测序分型相比,一致性为96.2%。荧光PCR是目前最灵敏的检测方法之一,检测极限可达到100 copise/ml的DNA浓度,以常规PCR为基础的分型方法常常需要进行2次PCR。荧光PCR分型实验仅需要DNA抽取和1次荧光PCR就可以了,免除第2次PCR、杂交、洗涤、显色等传统方法的诸多步骤。利用荧光PCR法检测HBV基因型基本不出现混合型,下一步有必要摸索混合感染或嵌合感染的分型反应条件和体系,目前本研究实现了在1个反应管对应一型引物探针组合的检测,为更加简便地进行基因分型,下一步将研究一管多荧光检测以及其他HBV基因型的检测。荧光PCR用于HBV DNA定量检测已非常熟悉,将基因分型与HBV DNA定量作融合检测亦有望会大大地方便临床应用。

2.逆向斑点杂交法   其原理就是将各种探针固定在基质上,用以检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。利用该技术在同一张尼龙膜上检测HBV基因型及YMDD变异,经济实惠、方便快捷,且易于开展。但由于该设计源于DNA芯片技术,而DNA芯片的基本原理就是逆向斑点杂交。众所周知, DNA芯片技术在研究各种疾病诊断、基因治疗和新药研发等领域中得到了广泛应用,但该技术所需仪器设备和各项条件在普通实验室均无法获得。

3.FeO/Au纳米颗粒探针法   其原理是利用DNA碱基严格互补配对的特性设计的,主要应用于分子的组装。运用金纳米颗粒基因探针与合成靶杂交,形成透射镜下明显的聚集体,可判断合成靶存在与否。使用双探针夹心杂交、纳米颗粒放大、显色技术,可检测合成靶DAN。制备Au纳米颗粒乙型肝炎病毒DNA基因探针,在玻片上目视化检测HBV DNA的多聚酶链反应产物。其方法是分别用枸橼酸还原金氯酸法、化学共沉淀法制备AU、FEO纳米颗粒,二法结合制备FEO(核) /AU (壳)纳米颗粒。通过金硫共价键,将烷氢硫醇修饰的寡核苷酸结合在纳米FEO (核) /AU (壳)颗粒上,制备纳米颗粒HBV DNA基因探针。该探针主要用于尼龙膜上和液相中的杂交反应来检测DNA,方法具有特异性好、结果直接、简单、价廉的优点,不需要配套昂贵的仪器,可望在许多领域,尤其是在许多基因检测芯片上有潜在的应用价值。纳米颗粒基因探针在液相中的杂交反应:纳米颗粒基因探针与合成靶杂交,透射电镜下可见明显的纳米颗粒聚集,敏感性较尼龙法高,并且特异性好。

4.错配聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法   该法利用错配PCR的原理扩增HBV前C区长194 bp,C启动子区长184 bp的基因片段,扩增产物分别经限制性内切酶Bsu 361, Bc1I酶切,琼脂糖凝胶电泳,根据酶切图谱多态性,建立检测HBV前CA1896, BCPT1762/A1764双变异的方法,对HBsAg、HBV DNA阳性的HBV感染者血清进行分析,酶切同时测序两份标本用克隆测序以验证酶切鉴定变异珠、野珠混合感染的准确性。对酶切、测序两种方法鉴定结果的比较分析发现在检测单纯野毒珠或单纯变异珠感染方面,两种方法的结果符合率为100%。在检测野毒珠、变异珠混合感染方面, PCR产物直接测序存在一定缺陷,它只能把其中的优势珠表达出来。而酶切法可把野毒珠、变异珠同时区分出来。此外本法仅需合成两对引物,只经过一轮PCR扩增,从模板DNA提取到酶切鉴定可在9 h内完成。操作简便,一步两酶切可检测绝大数的标本,图谱简明,能同时区分HBV前C A1896、BCP/A1764野毒珠和变异珠混合感染。适合较大样本量的分析,可用于流行病学调查及临床筛查。

5.乙型肝炎病毒DNA等温扩增技术  HBV的病毒载量与感染状态密切相关,寻求快速、简便、灵敏、特异的定量手段是对HBV早期诊断、病程监控流行病学调查的需求。2001年, NIH颁布的指南中推荐使用HBV核酸检测,等温扩增的最低检出下限为40拷贝/ml,相当于HBV DNA基因组1拷贝量。线性范围良好,预示着此方法对于低拷贝或高拷贝HBV感染者均适用。茎环结构是核酸天然存在的美妙现象,它与DNA、RNA、蛋白质的相互作用对于信号传递、细胞代谢等具有重要的调节作用。热动力学分析茎环探针较线性探针具更明显的特异性。现代探针诸如分子信标、蝎形探针更多的借助于核酸茎环结构的设计。

6.实时荧光PCR技术  可采用TaqMan探针技术和选择性引物的实时荧光PCR进行YMDD变异检测的实验方法。核苷类似物拉米夫定作用于HBV多聚酶逆转录酶的活性部位YMDD基原抗病毒效果显著,但长期使用对拉米夫定产生耐药。随着拉米夫定耐药珠的出现,国内外研究者都在寻找有效的检测方法。目前耐药突变的检测方法中一般认为测序法是检测YMDD变异的金标准,但测序成本高,过程复杂,需要昂贵的仪器设备,从而限制了其临床应用。基因芯片技术目前尚未成熟,仍需进一步研究。但由于病毒变异快速,即使有轻微的碱基变化,就会出现RFLP酶切位点的变化,出现新的酶切位点或原有的酶切位点消失,导致检测失败。而且RFLP完全依靠凝胶电泳来判断结果,敏感性较差,假阴性率较高。Real-timePCR技术的出现为核酸的检测提供了新的技术手段。通用模板PCR技术检测乙型肝炎YMDD变异珠与本方法有许多相似之处,但从通用模板PCR技术的方法学原理可以看出它与本方法相比特异性较差。采TaqMan探针技术和选择性引物的实时荧光PCR所建立的检测HBV拉米夫定耐药突变方法,能计算突变珠比例,与测序法符合率非常高,可以作为检测慢性乙肝患者拉米夫定耐药的有效手段。

 1．测序分析法（sequence-based test, SBT）   对 HCV 基因组的 E1、NS5b、C 区直接进行测序和进化树分析，是 HCV 基因分型的“金标准”。该方法采用特异性 PCR 引物扩增 HCV 病毒基因组多个区域，并联合多区域的测序结果描绘进化树。优点是获取序列信息最多，可以明确被测区域的多态性，并能发现新基因，是其他所有方法的参考标准。由于测序分析法所扩增的 E1、NS5b、C 区都具有高异质性，能准确区分出亚型，但又正是因为这些区域序列变异大，导致有时不能成功进行 RT-PCR 和测序；之外，测序法对混合感染也不易确定，而且测序法操作繁琐，耗时费力，仪器费用高昂，难以在临床上推广使用。

2.限制性片段长度多态性（restriction fragmentlength polymorphism, RFLP）   PCR-RFLP 是较早出现的 HCV 基因分型检测方法，利用 RT-PCR 扩增具有不同酶切位点的各种 HCV基因型，将 PCR 产物用 3～5 种不同限制性内切酶进行酶切，电泳结果与已知限制性片段数据库进行比较，从而确定基因型。 该方法扩增区可以选择 5'UTR、C区、NS5b选择 5'UTR 的该方法在检测主要基因型时效果最好，但是操作流程相对比较复杂，检测别有限。

3．实时荧光 PCR（real-time PCR）   根据荧光共振能量转移的原理检测 HCV 基因型，检测探针一般是 Taqman 或 MGB 探针，扩增区采用保守的 5'UTR，有研究显示 real-time PCR 检测结果与 LiPA 检测的一致较好。 该方法能较好的区分主要基因型。

4. 基因型特异性引物扩增法（PCR-SSP）   根据不同 HCV 型在某一区段序列的差异 ( 常选择 C 区、NS5b 区 )，设计一系列特异性引物，不同型或亚型可扩增出不同长度的片段，并以此进行分型。该方法操作虽简单，但要保证 HCV 各型之间有较大差异，不但对 PCR 引物的设计要求较高，且每份样品需同时进行多次检测才能最终确定型别。 该方法的优点是成本较低，不需要特殊设备，缺点是有时会出现较弱的扩增条带，难以判断，因而目前没有在临床或实验室广泛使用。

5．型特异性核酸探针杂交法（PCR-SSO）   根据各型 HCV 某一区段的序列差异分别设计特异探针并固定在纤维素膜或玻片上，利用 RT-PCR 通过生物素或荧光素标记的引物扩增 HCV 基因片段，产物与膜、芯片或微孔板上特异性探针杂交，酶联显色反应或直接经荧光扫描仪分析，判定 HCV基因型，这也是目前应用最多的一种基于核酸杂交的HCV 基因分型方法。 目前在临床实验室中广泛使用的线性探针杂交（line-probe assay，LiPA）就是型特异性核酸探针杂交分型方法。 该方法与测序结果比较，符合率高，且在检测混合感染时，比测序法更为优越，在国内外报道的 HCV 基因分型研究中常用，稍显不足的是，该方法对低载量病毒检测结果不太理想，可能原因还是与核酸的抽提、逆转录 PCR 效率不是很高有关。 若提高核酸纯化的质量和丰度，优化逆转录 PCR 扩增体系将会进一步提高该方法的灵敏度，从而达到更好的临床应用效果。

 HIV 呈球形或卵形，直径 100～120nm，为双层结构。 核心由 2 个相同拷贝的 RNA 及蛋白质、反转录酶、核糖核酸酶及整合酶组成，基因组除了具有逆转录病毒的基本结构———基因长末端重复序列（LTR)、核心蛋白（gag）、聚合蛋白（pol)、包膜蛋白（env)外,还有非常复杂的调控机制, 包括 tat、rev、nef、vif、vpr、vpu 等调节基因,其作用是在转录、翻译、装配等各个环节对病毒的生长和繁殖起调节作用。 核心外为病毒衣壳，病毒最外层为膜蛋白，包膜上有刺突。 gag、env 和 pol 是 HIV 的 3 种结构蛋白。所有核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白体上，P17 位于核蛋白与壳层之间的基质上，包被于包膜蛋白的内部。 P24、P40 和P55 构成核衣壳的外衣，包被于内部核酸的外围，故核衣壳主要为 P24。 包膜蛋白为糖蛋白，gp160 是前体分子， 在感染初期产生， 然后分解成 gp120 和gp41。 聚合酶蛋白包括 P66、P51 和 P31，它位于病毒的核区内，并与病毒核酸紧密相关。其功能为转录病毒 RNA 为 DNA，整合病毒 DNA 到宿主细胞的 DNA上，并切割前体分子使之成为有活性的小分子。HIV-1 的亚型分为 M、O、N 3 组。 M 组分为 A～ 10 个亚型，加上 O、N 型共 12 个亚型。近年来, 分子生物学技术不断应用于 HIV 的检测中, 核酸检测已经成为 HIV 实验室诊断的发展方向，可在发现血清学变化之前检测到 HIV 感染,而且比 P24 抗原检测方法更灵敏。

1.原位杂交（insite hyrization）   应用特定的标记探针以分子杂交法直接检测标本中的 HIV 病毒靶核酸，最初为放射性标记，后来逐渐发展为酶标记或化学发光试剂标记。 阳性较聚合酶链反应(PCR)稍低，随着核酸扩增技术的出现，基因探针技术也失去了应用价值。

2. HIV 核酸定性检测   通常采用 PCR 技术，能从HIV 感染后 1～14d 的患者血浆中检测到 HIV RNA,可用于急性感染期患者、 抗体检测不确定等情况的辅助诊断或用于血液筛查。尤其在 HIV 阳性母亲产下的婴儿是否感染 HIV 的诊断中有着非常重要的意义，前病毒 DNA PCR 检测法对出生 48h 内的婴儿检测敏感性为 38%, 出生 14d 的婴儿检测敏感性达 93%。传统的 PCR 技术由于需要开盖取样电泳，加之PCR 方法本身的敏感性极高，很容易导致“污染”，出现假阳性结果。 另外，由于 HIV 基因的多样性，没有一套引物可以覆盖所有的 HIV 序列，使检测的敏感性又受到限制。上述原因限制了 PCR 对于 HIV 感染诊断的临床应用。

3. HIV 核酸定量检测  HIV 核酸定量检测意义在于：①早期辅助诊断，可在其他血清学和病毒学标志出现前检出病毒核酸， 使窗口期缩短 6～11.5d；也可判定无症状、血清阴性患者潜在的 HIV 传染。 ②用于预测疾病病程和监测抗病毒治疗的疗效与病毒水平。 ③PCR 可用于判定婴儿出生后 18 个月内,其血液中的 HIV-IgG 抗体是否来自于母体, 婴儿是否感染 HIV。

（1） 逆转录 PCR 技术 （RT-PCR）   通过逆转录酶使病毒 RNA 逆转录为 cDNA，随后进行多聚酶链式反应，指数扩增 DNA 片段，将放大产物变性并与多孔板结合，利用酶联系统进行检测。 由于 RT-PCR技术可在 2h 内扩增产物达到凝胶电泳或实时荧光法可检测的水平， 多种改良的快速 RT-PCR 检测方法可实现 HIV 的快速临床诊。

（2）分支 DNA 信号扩大系统（bDNA）  是定量检测血浆中 HIV-1 型 RNA 的一种方法。 是指人工合成的带有侧链的 DNA 片段，在其每个侧链上都可以标记被激发的标记物。 因发光强度与样品中 HIVRNA 含量成比例，可通过发光强度来定量。 bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针， 可以方便地检测HIV 的部分变异株。 bDNA 不存在扩增物的交叉污染，这较 PCR 是一大进步；但灵敏度不及 PCR，提高bDNA 灵敏度是一大难点。

（3） 核酸序列依赖的扩增系统 (NASBA)  是以RT-PCR 为基础但无需将逆转录和 PCR 扩增分作两步进行，由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增 RNA 的新技术。 NASBA原理是提取病毒 RNA，加入 AMV 逆转录酶、核酸酶H（Rnase H）、T7RNA 聚合酶和引物进行扩增。NASBA 与 PCR 相 比 只 在 一 个 温 度 下 进 行(42℃)，无需热循环装置，可适用于野外现场和实验室不同条件。可以一次扩增足量的 RNA 用于多次研究和直接使用肝素抗凝的血浆样品， 适合对冻存血浆进行回顾性分析。因其高效扩增特性，可与多孔板酶介导的显像技术及荧光实时检测结合。 对传染病病原的定性与定量检测而言， 此类方法因扩增产物的不稳定性特征， 减少了分子诊断实验室扩增产物的交叉污染。 但该法操作较繁琐， 不适宜大批量处理，且扩增时退火温度较低,易引起非特异性扩增。

（4）转录介导的扩增系统(TMA)：TMA 技术原理与 NASBA 的不同之处为 TMA 利用的是 MLV 逆转录酶及 T7RNA 聚合酶两种酶, MLV 逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有 RNA 酶活性，反应在 41.5℃进行。

4.实时荧光定量 PCR 技术   指在 PCR 反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号实时监测整个 PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 一般使用 TaqMan 探针或 Sybr Green 荧光染料， 但 Sybr Green 染料不能区别目的产物和非目的产物， 使结果有偏差， 特异性不如 TaqMan 探针好，所以现在广泛使用的是 TaqMan 探针技术。 荧光实时 PCR 检测技术的应用，改变了传统的电泳终点检测，可以进行实时监控，得到 S 型扩增曲线。 与常规相比,具有特异性强、自动化程度高、有效解决污染问题等特点。 该方法可以检测血浆中的病毒载量,也可以检测血液中单个核细胞的前病毒载量。

5.连接酶酶促.链式反应(LCR)   是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术，是继 PCR 后新发展的一种较有前景的体外扩增技术。

6. 基因芯片检测技术   是 PCR 技术与核酸分子杂交的结合,通过对 HIV 基因组分析,将该病毒的高度保守序列作为鉴定指标, 可直接对病毒病原体进行检测， 极大地提高了诊断的准确性。 DNA 芯片,对 HIV-1 逆转录酶及蛋白酶的基因突变进行筛选, 并跟踪监测 HIV拮抗药物的产生和突变、 疾病相关基因型以及患者在治疗中的反应。应用 DNA 芯片技术在艾滋病患者出现抗体反应前检测 HIV,对艾滋病的早期诊断有十分重要的意义。国内也有文献报道采用基因芯片检测 HIV。由此可见,基因芯片在鉴定 HIV感染中具有其他方法无可比拟的优越性。虽然基因芯片技术尚需要进一步完善， 但是可以预见，在未来的几年里，其应用前景是好的。 不仅可用于 HIV 的耐药性检测和基因诊断，甚至可以把许多致病病原体的基因集中在一张芯片上，同时对许多微生物的感染进行诊断。