分析方法学验证技巧与重点

对于药学领域的方法验证ICH、药典委员会、CDE等权威机构都有相应的指导原则，虽然内容各有不同，但总的思路和原则其实是一致的。指导原则写的是一些很宽泛的指南性的内容，很少涉及具体操作以及为什么要这么做。笔者撰写本文的目的就是根据自己的经验和理解，深入剖析每个验证概念的含义，详细说明方法验证应该怎么做，为什么要这么做，以此为新进入药学研究领域的同仁解决所以然的问题。目标定这么大，而能力又实在有限，不当之处在所难免，敬请方家指正。以下具体操作过程及相应数值，可以作为参考，并不一定适用于所有情况。欢迎一起交流，本人微信morice999。

1.概念解析

专属性系指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等）存在下，采用的分析方法能正确测定被测物的能力。

这句话的意思是被测物在其他成分的干扰存在下，依然能得出合理的结果。除去被测物之外，所有其他成分都是干扰源，以含量测定（外标法）为例，被测物是主成分峰，除此之外的供试品溶液中的一切其他成分都是干扰，包括稀释剂、辅料、有关物质、无机盐、残留溶剂等等。研究不可能覆盖所有的可能性，只需要研究高风险因素，一般来说稀释剂、辅料和有关物质是专属性的高风险因素。

2.怎么做？为什么？

1)主成分峰纯度

在专属性验证的相关实验中，主成分峰都应该考察峰纯度，确认主成分峰为单一成分的峰。具体做法是用DAD检测器进行峰纯度扫描或者用LC-MS确认没有其他成分。

2)稀释剂

应考察稀释剂对被测物的干扰，空白稀释剂出的峰应不干扰被测物。具体做法是按照质量标准规定的进样量检测空白稀释剂，记录色谱图。

3)辅料

取质量标准规定量的供试品中等量的空白辅料，按照规定分析处理，记录色谱图，空白辅料峰应不干扰被测物。

4)有关物质

有关物质分为两大块：工艺杂质和降解杂质。如果在二者均可获得的情况下，将杂质分别定位，并配制一份混合溶液，根据检测内容的不同分别研究。含量测定各杂质峰应不干扰主成分的检测，即各杂质峰应和主成分峰达成基线分离，各杂质峰之间没有要求，重叠也无妨，因为含量测定只需确认主成分峰不受干扰即可。有关物质中各杂质峰和主成分峰之间的分离度均应符合要求，一般不小于1.5。特殊情况可将某些杂质合并控制，如互为对映异构体的非对映异构体，它们在反相色谱法中一般都是重叠的峰。

如降解杂质不可获得，应进行酸碱氧化破坏条件下考察可能的降解杂质的干扰，该实验一般都做，但不是必须做，如果已经对降解杂质有了充分的研究，就无需做破坏实验。例如已经有了有效期内长期稳定性的研究结果，确认了稳定性期间的实际降解杂质。因为有些情况下，破坏实验的结果不是真实可能的降解杂质，这种情况以双氧水进行氧化破坏最为常见，破坏产物杂乱无章，甚至有可能因为该实验推翻分析方法。降解实验室一个很大的内容，所以在下个章节详细论述，需要注意降解实验应归属在专属性验证项下。

降解实验的做法各相关指导原则都没有提出具体的措施，所以各个实验室做法各有不同，本文阐述的是个人看法，并力图证明其合理性。

为尽量避免降解实验产物与实际可能产生的降解杂质的不一致的可能，降解实验应为长时间弱条件下进行。本人不建议用强条件如高浓度酸碱和双氧水并辅助加热等做法，因为强条件下可能会形成二次降解产物，并出现许多降解产物峰，增加方法验证的难度，而实际稳定性期间出现的降解杂质可能就一两个甚至没有。

降解实验的目的为了预测稳定性期间的降解杂质，不是为了破坏而破坏。比如有说法应将主成分破坏5%-20%之间，但是一般条件破坏不了，就加强条件，必须在这范围内。而这是没有必要的，也是不合理的。以下内容详细论述我的降解实验的一般做法，个人见解，仅供参考。

1.破坏条件与操作 

配制一份5/10倍浓度的供试品储备液，分别取5ml置25/50ml量瓶中，分别加入0.1mol/l盐酸溶液、0.1mol/l氢氧化钠溶液、0.1%双氧水溶液(如氧化破坏杂质多而乱，可考虑更弱的条件，如溶液中充氧气饱和)5ml，室温放置1天，酸、碱分别加等量碱、酸中和，再分别加稀释剂稀释至刻度，。

另分别取0.1mol/l盐酸溶液、0.1mol/l氢氧化钠溶液、0.1%双氧水溶液5ml置量瓶中，同法操作，作为各破坏条件下的空白。如为制剂，应同法做空白辅料的破坏实验。

取上述5/10倍浓度的供试品储备液5ml置25/50ml量瓶中，加稀释剂至刻度，作为供试品溶液。

分别取上述溶液，按照质量标准规定进行分析，记录色谱图。

注意：酸、碱和双氧水溶液浓度和放置时间均可以根据破坏情况进行调整，如某个条件有降解倾向，应调节条件使破坏至5%-20%之间。如三者均未发现降解倾向，再放置一段时间如10天，依然如此，既可说明本化合物非常稳定，稳定性期间应不会产生降解杂质。本人有一个项目按此条件做破坏，均未产生破坏产物，长期稳定性试验2年，有关物质检测结果和0天分毫不差。

2.数据报告 

1)峰纯度

各条件下的峰纯度应符合要求。

2)分离度

含量测定方法各破坏产物应与主成分达成基线分离，有关物质方法各破坏产物与主成分、现有杂质之间的分离度均应不小于1.5。

3)质量守恒