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 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
细胞准备 对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
固定 根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min.
通透 使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.
封闭 使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.
一抗结合 室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min.
二抗结合 间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
封片及检测 滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。。
| 问题 | 可能原因 | 优化方案 |
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| 信号弱或无信号 | 目标蛋白在细胞中没有表达 | 制备细胞裂解液，用Western Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达 | 染色细胞过少
| 表达目标蛋白的细胞过少 | 标本中使用更多的细胞，试用其他瞬时转染方法，或者使用稳定 | 转染细胞系 细胞通透性差 | 增加通透剂作用的时间或者浓度，或改用其它的通透剂 | | 染色前的固定步骤破坏了抗原表位 | 改用其他固定方法 | 通透使抗原丢失
| 减少通透剂作用的时间或强度 | | 抗体不识别 | 换用其他抗体 | | 一抗稀释度过大 | 同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释比例 | | 二抗选择错误 | 使用正确的二抗 | | 背景过高 | 一抗质量不高 | 使用特异性高，效价高的一抗 | | 一抗浓度太高 | 同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释比例 | | 二抗浓度太高 | 同一样品按最佳的一抗用量作二抗稀释曲线，以确定最佳的二抗稀释比例 | | 封闭不完全 | 使用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭；改善封闭条件 | | 封闭液BSA中含IgG | 使用高纯度（IgG free）的BSA
| | 洗涤不充分 | 充分洗涤 | | 细胞呈扁平状 | 细胞片被风干
| 在任何时候都不要让细胞片干燥；使用湿盒 | | 使用了甲醇固定 | 甲醇可破坏细胞膜，因此不能很好保持细胞形态。改用甲醛或戊二醛等其他固定剂 | | 细胞有自发荧光 | 使用了戊二醛固定 | 在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光 | | 材料本身（如石蜡）有自发荧光 | | 细胞模糊，封片剂明亮 | 因洗涤不充分导致背景太亮 | 充分洗涤 | | 二抗结合太弱 | 确保抗体牢固结合，确保固定良好 | 整个细胞片都出现荧光亮点
| 二抗浓度过高 | 降低二抗浓度 | | 二抗发生沉淀 | 过滤或离心荧光标记二抗 |
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