染色体(非整倍体)检验：荧光原位杂交技术

王兴光  河北省沧州市人民医院产前诊断中心

        荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性的分子标记技术。其操作简单，应用在染色体非整倍体的检验中，标本主要有两种：绒毛组织（或胎儿肌肉组织）和羊水。对于两种标本的处理过程基本相似（绒毛组织包括剪碎步骤），包括：离心弃上清、低渗（氯化钾溶液）、预固定（甲醇：冰乙酸为3：1）、固定、杂交探针（然后温箱过夜）、复染、荧光显微镜下计数等等。

        人类正常染色体核型为：46，XX或46，XY。但某些情况下，会出现染色体数目及形态异常，其中染色体形态异常主要包括易位（如罗伯逊易位）、倒位（可分为臂间倒位和臂内倒位）、缺失、重复等，最近微重复和微缺失（可以采用基因芯片技术发现）也逐渐引起人们的重视；染色体数目异常主要表现为：非整倍体（如单体、三体，且以三体症最常见），主要原因是生殖细胞在减数分裂时染色体出现不分离。在产前筛查与产前诊断中主要关注21-三体综合症、18-三体综合症、神经管缺陷。常规流程是：在产前筛查中出现21-三体综合症、18-三体综合症、神经管缺陷高危或者临界风险，需要进行产前诊断，这种情况要进行羊水检验。羊水细胞检验最佳时间是孕18-22周，通常包括羊水细胞培养及染色体核型分析、荧光原位杂交。核型分析是对23对染色体分析，而荧光原位杂交只分析18号、X、Y、13号、21号染色体，不涉及染色体形态学方面，具有快速、准确的特点，可以对核型分析结果进行验证，确保产前诊断的准确性。 由于羊水培养会出现培养液污染、细胞生长不良、染色体收获不成功等原因，使得荧光原位杂交技术能够对羊水细胞培养及染色体核型分析进行补救。

        自然流产是一种由多因素造成的不良妊娠结局，是妇产科常见疾病，其发率占全部妊娠结局的10%-15%，多数发生在早期，妊娠终止在12周前者称为早期流产。在临床上最主要的原因是：染色体原因，即染色体非整倍体的出现，早期流产中胚胎染色体异常约占50%-60%，染色体异常中数目异常占86%。对于反复自然流产的情况应查找病因，采用荧光原位杂交技术对流产组织进行染色体数目的检验，主要包括：16号、18号、22号、13号、21号、X、Y染色体。临床上对于有反复流产史的孕妇，究其原因多为16号染色体数目异常。流产FISH检验对于样本要求：标本需新鲜，优选绒毛作为实验材料，新鲜绒毛为密生的指状或树枝状小突起的细胞团，表面被覆着上皮组织，内部毛细血管丰富，与结缔组织贴附。

        荧光原位杂交技术检验原理：使用流产术后或羊水的细胞样本制片，经过预处理后即可用于荧光原位杂交分析。胎儿绒毛组织或羊水细胞核中脱氧核苷酸（DNA）与特异性荧光原位杂交探针分别在高温（通常76℃）下变性成单链脱氧核糖核酸，在42℃环境下（一般过夜）这些已变性成单链的样本及探针核酸根据碱基互补的原则进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸，将非特异性性杂交洗涤（70%乙醇，85乙醇，无水乙醇）后，探针上标记的荧光信号即可在荧光显微镜下被检测。

        荧光原位杂交技术结果分析与解释：一般随机计数100个细胞，90%以上的细胞显示正常细胞类型提示正常样本；60%以上细胞显示异常信号类型提示异常标本。需要注意的是，对于杂交不均匀的区域不要分析，细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析，所计数的细胞必须是通道信号均清晰可辨的细胞。

        荧光原位杂交技术在染色体非整倍体的检验中具有重要的意义，在临床上应用广泛。但此技术仍有其局限性，主要检测染色体位点和着丝粒数目的变化，不能用于单个碱基突变的检测。荧光原位杂交在其它领域也有重要的用途，如乳腺癌患者术后检测HER-2基因指导用药等等。