长篇医学解读——融合基因检测的灵敏度是多少？

　对于大多数融合基因的检测，目前几乎学界都公认基因检测是灵敏度最高的监测微小残留病的方法。所以很多患者对基因检测的灵敏度和精确度都非常关注。下文进行解析。

　　医学解读——融合基因检测的灵敏度是多少？先来解答两个疑问：

　　一、什么是灵敏度/敏感度：意思是说有多低比例的肿瘤细胞能够检测出来。

　　二、什么是精确度：这是指检测量值与实际值的符合程度。在融合基因检测时，检测值并不确切地对应细胞数的比值，因此精确度更多地反映为不同次检测值的变异程度。

　　目前检测融合基因常用的方法检测灵敏度可达到10-6，也就是说每106个细胞中有一个肿瘤细胞能够检测出来。这个基本上是方法学上决定的最佳检测灵敏度，也有说可至10-7的，除非用了特别的方法，否则有夸大之嫌。而且10-6这个数值也是在各方面条件都比较理想的情况下才能达到。从标本到实验流程的各个环节都可能会对检测灵敏度有不利影响。

　　首先从标本量来说，很多人关注采血或骨髓标本的体积数。不同的专家都强调血样标本的体积数，有的甚至要求40ml血。尤其外国专家一般要求患者采集更多的血样标本，这个和做事习惯和社会环境都有关的，很难一下说清楚。

　　重要的是细胞数，而不是体积

　　但实际上不是专业人士想想也会知道，其实我们做检测时应该关注的更重要的是细胞数，而不是血液的体积。脱离血细胞计数妄谈体积有点太死板了。事实上在2008年在悉尼召开的国际实验血液学研讨会上对BCR-ABL1检测的指导意见中关于标本采集中也指出：重要的是细胞总数有保证，而不是标本的体积。

　　在进行融合基因检测时，现在世界上大多数实验方法都是最佳处理1-2×106个有核细胞中的RNA。也就是说不管你送的标本里有多少个细胞，在前期的标本处理时实际使用的只有这么多，其它的并没有被真正检测使用。正常人外周血的白细胞计数是4000-10000/ul，也就是说如果白细胞计数正常的话，大概实际检测的细胞来源于仅约0.2ml血。如果是一个慢粒（CML）患者，白细胞计数会超出正常人许多，这时只需要更少的血就够用了。但如果化疗后或移植后等骨髓抑制期白细胞计数很少时，就需要增加标本量了。

　　在进行后续检测时，每个反应里面能够检测的标本量也是有限的，过多的标本对检测的灵敏度也有不利的影响。这是由于实验技术本身的限制，很难讲的细致，但目前常规用于临床的方法还没有办法突破这个限制。

　　检测要选择新鲜的标本，如何运输？

　　标本的保存和运输不当也会对检测灵敏度有一定的影响。当然是越新鲜的标本越容易保证检测灵敏度，陈旧的标本会因为RNA的降解而降低检测灵敏度。但并不是每个外地患者都方便到医院来采集标本，所以快递方式邮寄标本往往难以避免。这时不同情况对检测灵敏度的影响有多大就难以评估了。据经验，在标本采集良好、细胞量足够并且实验过程控制良好的情况下，常温运输或4℃放置3天的标本检测灵敏度并不受到显著的影响。

　　因此送检时最重要的是标本中细胞数达到一定的量就可以了，这个量应该是多少呢？不同的人同样会有不同的判断。考虑到白细胞计数的不确定性、可能会有凝血、标本处理过程中的丢失、很多时候需要预留一些标本以备重复实验或加做其它检查等因素，多送一些标本（理论值十倍以上）是必需的。可以肯定的是：

　　①：如果处理标本后得到的细胞总量不足1-2×106，是无法保证最佳的灵敏度的；

　　②： 因为后续处理和实际检测的细胞量有限，40ml不会比20ml的标本量对检测灵敏度更有帮助。

　　对于外周血白细胞计数不是很低的患者，检测融合基因时，我们一般推荐送检3-5ml骨髓或外周血。白细胞计数过低的标本就要根据情况增加送检的标本量了。这样大多数标本我们都能保证获取到足够的细胞数进行后续的检测，但往往也会有送检的标本量难以达到的情况。比如骨髓干抽、脑脊液标本等，这时即使细胞数达不到2×106也有检测的意义，检测灵敏度就要看具体情况了。

　　对于快递的标本，我们一般的推荐是：夏天天气太热时，最好快递时冷冻后的医用冰袋（这个不会化成水）将标本保持低温，因为快递过程中可以产生高温，会对细胞活性有不利影响；冬天或天气并不炎热时，可以室温运输；3天之内到达都可以进行检测；更长时间到达也可进行检测，但检测灵敏度可能会受到一定的影响。

　　理论上讲快递过程中低温保存是最好的，会延缓RNA的降解，但事实证明并不是完全必须的。并且低温时一定要注意不要使标本冷冻，这样会对标本有一定的影响。如果几小时内就能送达的标本，完全不必低温保存，甚至如果有条件的话，揣在怀里使其接近体温更好，因为这样使细胞更接近于体内的环境和活性。

　　影响灵敏度的相关实验流程

　　如果细胞量足够了，标本保存也比较合适，那么影响检测灵敏度的就是实验流程的质量控制了。RNA非常不稳定的特点决定了它的检测流程复杂并且每个环节控制不好了都会对检测结果造成严重的影响，实际上实验人员的操作和实验室的质控是影响检测灵敏度的最常见和最重要的因素。

　　首先刚才说了，如果提取RNA时一味增加处理的细胞数量反而会得到质量更差的RNA，对结果有不良影响。所以我们处理标本时并不是以处理初始的血液或骨髓体积为准，而是根据裂解红细胞以后富集的白细胞数进行调整，调整为约1-2×106个细胞后再进行下一步处理。也是因为这个原因，我们坚持不用全血直接提取RNA的方法。因为血液病的标本有其特别之处，同样是0.2ml全血，其中的白血病数可能相差千倍甚至更多。

　　即使细胞数合适了，操作人员的素质也很重要。和其它很多实验操作不同，80%的人开始练习提取RNA时会不成功，需要比较多的培训，养成良好的操作习惯才能保证RNA在提取过程中不被降解并且保证其纯度。实际上我们帮助一些实验室复核的标本中，绝大多数影响检测的情况在这个过程。降解和纯度都会对后续的检测有严重的影响。

　　后续的实验操作也会对检测灵敏度有一定的影响，但相对来说容易做稳定一些。但定量检测的精确度主要受这部分操作的影响，合理的实验流程安排和准确的手法有助于保证检测的精确度。一般来说，融合基因表达量较高时更容易保持精确度，融合基因定量低时相反：如100%左右的检测，在我们实验室的重复误差一般不超过0.5倍；而0.001%左右的检测，由于反应体系中仅有很少的融合基因数，这时的系统误差就可能会比较大，这是无法避免的，所以这时即使两倍的变化也可能属于正常的误差范围。

　　至于内参基因，现在基本学界公认血液系统的检测用ABL1是最合适的。大家看基因定量检测的报告，ABL1数值越大，一般说明标本制备情况越好，检测灵敏度也就越有保证。但由于实验流程中各个环节都可能会受一定因素的影响，往往难以保证每份标本都能达到最理想的状态，我们只能尽力去做。对于一些特别的标本，如脑脊液等细胞数本来就大大低于理想值时，ABL1内参的检测值可能会小的多。这时本身也是有意义的，总不能对总数500个细胞要求检测灵敏度达到10-6吧。

　　还有重要的是标本采集时要用EDTA抗凝几乎是现在基因检测的共识，枸橼酸钠抗凝的也可以。尽量避免用肝素抗凝，因为标本处理时往往难以完全清除里面的肝素，而肝素很容易对后续的检测有严重的不良影响，从而严重影响检测灵敏度。

　　如果必须使用肝素的标本，请告知医者，以便医者对标本进行特别的处理，以最大限度地消除肝素的影响。

　　Paxgene管有利于长期运输标本时防止RNA的降解，另一方面理论上讲也有利于RNA的表达情况保持在标本刚才采集时的状态。但其对后续的RNA分离和检测并无促进甚至有时有不利的影响，另其价格昂贵。而且我们也没有看到充分的资料和证据表明标本的短期放置会对白血病中常见的融合基因的相对表达量有显著的影响。我们并不认为Paxgene管对于常规的检测有益，当然需要长期保存和运输的标本可以考虑使用。

　　总之，RT-PCR检测检测融合基因是一个很复杂和容易受影响的流程，要保证最佳的检测灵敏度和准确性需要各个环节都比较到位才行。