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荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示核酸序列位置的方法。该技术问世与70年代中期左右，其曾多于与染色体异常的研究，近年来随着FISH探针种类的不断增多，使得该技术逐步应用于各种领域。该技术具有快速，安全，灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学，肿瘤生物学，基因定位，基因作图，基因扩增及分子诊断等领域。 1对于FISH操作来说，那些因素比较重要？ 在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度，因此探针要避光保存，其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片且避光保存；各种试剂pH也要精确达到要求，这也直接关系到FISH的稳定性。 2 如何保证FISH操作中的温度？ 最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作，如Vysis的Hybrit FISH杂交仪。如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在0.5度以内）。其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。同时检测的样本最好不能超过4块。操作中的行动一定要迅速。操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。因此对上述小部件的要进行预热处理，不然会影响FISH的杂交效果。 3 使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号，但随后信号急剧衰减，几分钟后信号就消失了。这是探针本身的质量问题吗？ 正常情况下，商业化探针即使是杂交后，如保存适当，荧光信号能保持半年以上。出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。因此在操作和观察时，尽可能在暗室中操作，也可以在封片观察时加入一定的antifade（抗淬灭剂）以延缓荧光素的淬灭。 4 如何配制各种试剂呢？ 强烈建议使用灭菌去离子水配制各种所需的试剂。此外，配制后使用pH计检测是否符合要求。配制的各种试剂都要采用超纯级要求。每次FISH使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。洗脱液和变性液当天用当天配。 5 直标型探针和间标型探针有何不同？ 为什么我们要选择直标型探针？所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也不断提高。因而在FISH检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。 6 能对同一样本进行多次的FISH操作吗？ 在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。如果我们使用的是直标型探针，还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。针对不同的样本，处理方法略有不同。外周血样本的处理： 1、使用镊子小心地揭去杂交区的盖玻片 2、将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。对于多次杂交，复染液浓度的降低有利于保持探针的亮度。曾有报道在同一样本片上进行了多达8次的FISH操作。也可对已经进行G带显色的样本片进行FISH操作：将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。 8 FISH技术有哪些主要优势？ ① 安全、快速、灵敏度高； ② 探针能较长时间保存； ③ 多色标记，简单直观； ④ 可用于中期染色体及间期细胞的分析； ⑤ 可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。 9 目前能开展原位杂交这方面工作是否相对可信的公司？ 上海舜百生物可提供原位杂交技术服务项目，那边公司在正式接受实验委托三周内（客户需要提供探针和检测样本）交付实验结果，所提供实验结果忠实于样本的实际情况。如果有相关意向可以，与那边取得联系。目前主要集中在DNA水平方面检测，而针对RNA这块比较困难。 10 原位杂交技术的发展前景如何？ FISH 技术作为连接分子生物学与细胞生物学的桥梁地位已为世人所公认。尽管目前FISH技术无法达到百分百完全杂交，特别是在应用较短cDNA探针时存在杂交效率明显下降的问题，但随着各种新型分子探针以及更为精密高端的光学显微镜和功能强大的计算机分析系统的不断问世，上述问题将会逐步得到解决，该技术的作用正变得日益重要，应用领域也得以不断扩展。FISH技术在泌尿系统肿瘤研究领域的巨大潜力与光明前景将引领我们进入全新时代。 |
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